口 病 誌1992,
原
Bisphenol
Aの
59/2
439
著
感 作 性,
交 叉 反 応 性 お よ び
抗 原 決 定 構 造 に 関 す る研 究
折 原 二 郎 東京医科歯科大学歯学部歯科理工学第2講座 (指導: 佐藤温重教授) 1992年3月9日 受付) Sensitizing Antigenic
Capacity, Determinants
Jirou Department
of Biomaterials
Cross-reactivity of Bisphenol
and A
Orihara
Science, Faculty of Dentistry, Director:
(
Prof. Atsushige
Tokyo Medical and Dental University Sato)
(
Bis-GMA and epoxy resins are known to cause allergic reactions in some patients. The purpose of this research was to investigate the sensitizing capacity, cross-reactivity and antigenic determinants of bisphenol A (BPA) , a major constituent of Bis-GMA and BPA type epoxy resins. Anti-BPA antibodies were prepared from mice injected with BPA-ovalbumin conjugates (BPA-OVA) , and the reactions of the structurally BPA-related compounds were compared with that of BPA using these antibodies by the enzyme immunoassay (ETA) and EIA inhibition test. The findings are as follows: 1) Injection of BPA failed to generate anti-BPA antibodies. However, injection of BPA-OVA was effective in producing antibodies strongly reacting with BPA. 2) Polyclonal anti-BPA antibodies cross-reacted with bisphenol B (BPB) , p-isopropylphenol (IPP) , diethylstilbestrol (DES) and 2, 4-dinitrophenyl (DNP) . 3) Five kinds of monoclonal anti-BPA antibodies were obtained. These monoclonal antibodies reacted specifically with BPA and moderately cross-reacted with IPP, DES and BPB, but not with DNP. The results suggest that BPA-OVA is capable of eliciting anti-BPA antibody production in mice and that the antigenic determinant of BPA is the structure of one central carbon atom, covalently bound with two phenyl groups and two methyl groups.
1.緒
性 試 験, 慢 性 毒 性 試 驗, 感 作 性試 験, 局 所刺 激 試 言
験, 埋 植 試 験 な どが実 施 され, 可能 なか ぎ り副作 用 の 少 ない 材 料 が選 別 され て い る。
近 年, 歯科 材料 の生 物 学 的 安 全 性 が 重 要 視 され
最 近, 歯 科 材 料 に よ る副 作用 の 中で ア レル ギ ー
る よ うに な り, 有用 性 が認 め られ た 新 しい 歯 科 材 料 を 生 体 に適 用 す る場 合 に は十 分 な安 全 性 が 求 め
が 注 目され, 歯科 治療 を 受 け る患 老 の み な らず,
られ て い る。 そ の 前 臨 床 的 毒 性 試 験 と して 急性 毒
歯 科 医 師, 歯 科 技 工士 を は じめ とす る歯 科 医療 従
(139)
440
口病 誌
平 成4年6月
事 老 の 側 で も 重 大 な 関 心 事 の 一つ に 挙 げ ら れ て い
と再 接 触 す る と炎 症 性 リ ン ホ カ イ ン を 産 生 し, 局
る1∼3)。 金 属 材 料 に 起 因 す る ア レ ル ギ ー に つ い て
所 に 好 中 球,
は 古 くか ら報 告 が あ り, 1928年
生 ず る 反 応 で あ る。1∼
にFleishmannら
マ ク ロ フ ァ ー ジ の 集 積 を 伴 う炎 症 を 皿 型 は液 性 免 疫 で 即 時 型
は ア マ ル ガ ム に よ る 口 内 炎, 皮膚 炎 が 水 銀 ア レ ル
過 敏 症 で あ り, IV型 は 細 胞 性 免 疫 で あ り遅 延 型 過
ギ ー で あ る こ と を 報 告 し た 。 そ の 後,
コ
敏 症 で あ る。 歯 科材 料 に よる ア レルギ ー は主 とし
バ ル ト, ニ ッ ケ ル, パ ラ ジ ウ ム に つ い て も ア レ ル
てIV型 で あ り, 接 触 過 敏 症 が 多 い 。 一 部 の 歯 科 材
ギ ー 惹 起 性 が 明 ら か と な っ た 。1940年
料,
ク ロ ム,
代にアク リ
ル レジ ンが 歯科 医療 に導 入 され るに お よ び義 歯 床 用 レ ジ ン に よ る ア レ ル ギ ー 患 者 が 漸 増 し, ー, 重 合 開 始 剤, 安 定 剤,
モ ノマ
従 来,
色 素 な どが ア レルギ ー
NuvaFil (R) bisphenol
が,
がAdaptic (R) と
が(
作 性 を 調 べ る も の で あ る。 ハ プ テ ン と考 え ら れ る 低 分 子 物 質 の 抗 原 性 を 明 ら か に す る た め に は, 低
に対 す るア レル ギ ーを 報 告 した
当 該 患 者 は パ ッチ テ ス ト でConciseの
GPM-test)
行 わ れ て き た6∼8)。 こ の 試 験 は 被 驗 物 質 の 皮 膚 感
感 作 物 質 と 考 え た 。Niinimaki
ら5) はConcise (R)
1型
歯 科 材 料 や 医用 材 料 の感 作 性 試 驗 に はモ
guineapigmaximizationtest,
に 対 す る ア レ ル ギ ー 患 者 を 報 告 し, Aを
ア レ ル ギ ー が あ る が,
ル モ ッ ト を 用 い た マ キ シ ミ ゼ イ シ ョン テ ス ト
の 原 因 と な る こ とが 知 ら れ て い る 。 レ ジ ソ 系 充 填 材 料 に つ い て は, Nathansonら4)
医 用 材 料 で はH型
は まれ で あ る。
分 子物 質 単 体 の 他 に タンパ ク結 合 体 を 感 作 抗 原 と
成分
し, 感 作 成 立 を 多 く の 指 標 で 検 索 す る 必 要 が あ
に は 存在 し ない エ ポ キ シ レジ ン に も陽 性 反 応 を呈
る 。 し か し, 歯 科 材 料 に つ い て こ の 種 の 研 究 は ほ
し た こ とか ら 判 断 し, Concise中
とん どない 。
bisphenolAの
誘 導 体,
に 含 まれ て い る
す な わ ちBis-GMAと
歯 科 用 レジ ン に は種 々 の ポ リマ ーが 利 用 され て
の 交 叉 反 応 に よ る ア レ ル ギ ー と判 明 し た 。 歯 科材 料 の 中 で ア レル ギ ー の原 因 と な る もの は
い る.bisphenolAは
コン ポ ジ ッ ト充 填 材 の 成
分 と な るBis-GMAや
多 様 な 用 途 の あ る エ ポキ
シ 化 合 物 等 の 合 成 の 出 発 物 質 で あ る 。Bjorker
多 くが ハ プ テ ソ で あ り, 生 体 成 分 と結 合 し て 完 全 抗 原 と な る 。 一 般 に, 抗 原 に 対 す る 感 作 成 立 の 過
ら9, 1o)は, AdapticやConciseの
程 は 液 性 免 疫 と細 胞 性 免 疫 と が あ り, 液 性 免 疫 で
thylene
はIgM, れ,
IgG,
血 中,
IgE抗
あ る い は 細 胞 障 害 性T細
生 さ れ る 。CoombsとGe11は ら ア レ ル ギ ー を1∼IV型 た 。 す な わ ち,
胞 (Tc)
ま で は 陽 性,
の 四 つ の タ イ プに 分 類 し
は 陰 性,
り, II型 はIgMあ
方,
体 の 関与 す る反 応 で あ
る い はIgG抗
体 が 産 生 され,
K細 胞 が 関 与 す る 抗 体 依 存 性 細 胞 媒 介 性 細
1, 850で
は 陰 性,
epichlorohydrinは
感作 能
イプのエポキシ は, 分 子 量1, 280 ま たbisphenolA 陽 性 で あ っ た11) 。 一
エ ポ キ シ レ ジ ン は 用 途 が 広 く, 繊 維 ガ ラ ス, 織 物 に 付 い て い る ラ ベ ル,
ン ダ ル,
カ ニ ュー レな どにエ ポ キ シ レ ジ ンあ るい
胞 障 害 作 用 に よ り組 織 の 細 胞 が 障 害 さ れ る 反 応 で あ る 。 皿 型 はIgMあ
告 が あ る12∼17) 。 と こ ろ が,
体 が 組織 中
行 い,
Bis-GMAは
接 着 剤,
はbisphenolAに
る い はIgG抗
お
あ っ た と し て も 低 い と 報 告 し て い る。
レ ジ ン に つ い て のGPM-testで
作用 機 序 の 相 違 か
IgE抗
っ い てGPM-testを
bispheno1Adiglycidyletherタ
が 産(
成 分 のtrie-
dimethacrylate (TEGDMA)
陽 性 率 は7%,
が な い か,
胞
1型 は ア ト ピ ー ま た は ア ナ フ ィ ラ
キ シ ー 型 と よ ば れ,
補 体,
TEGDMAの
組 織 液 中 に分 布 す る。 細
胞 性 免 疫 で は 遅 延 型 過 敏 反 応 に 関 与 す るT細 TDTH) ,
よ びBis-GMAに
体が免 疫 系 臓 器 で塵 生 さ
リ ン パ 液 中,
glycol
ワ ッ ク ス,
サ
よ るア レル ギ ー性 皮膚 炎 の報 エ ポ キ シ レジ ン は ア
これ に よ り活性 化 され
レル ギ ー性 皮 膚 炎 の 原 因 物 質 と して の 頻 度 が 高い
た 補 体 な ど に よ り組 織 が 障 害 を 受 け る 反 応 で あ
に も か か わ ら ず, 感 作 源 そ の も の は 不 明 で あ る 場
る 。IV型 は マ ク ロ フ ァ ー ジ を は じ め と す る 抗 原 提
合 が 多 い18》。
の 抗 原 と複 合 体 を 形 成 し,
示 細 胞 に よ り抗 原 を 認 識 し た 感 作TDTHが
臨 床 的 に はア レル ギ ー疾 患 の 原 因 除去 療 法 に 際
抗原
(140)
口 病 誌1992,
図1
bisphenol
A,
epoxy
resin,
して, パ ッチ テ ス ト等 で 感 作 物 質 を 同 定 し て い
Bis-GMAモ
59/2
441
ノマ ー の構 造 式
一タ ン パ ク結 合 体 に 対 す る 抗bisphenolAポ
リ
る。 しか し, パ ッチ テ ス トは 偽陽 性 反応 を 呈 しや
ク ロー ナ ル抗 体 の交 叉 反 応性 にっ い て 比較 検 討 し
す く, ま た, パ ッチ テ ス トで 陽 性 を示 す 物 質 が 実
た 。 さ ら に3)
際 の 感 作 物 質 と交 叉 反 応 を 起 こ して い る場 合 もあ
異 性 を 調 べ る た め に, bisphenolAに
り うるの で, パ ッチ テ ス ト等 の 感 作 試 験 のみ で は
ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 作 製 し, そ の 抗 原 特 異 性 に つ
感 作 物 質 の 同 定 は 難 しい もの と思 わ れ る。 現 在 ま
いて 免 疫 学 的 に検 討 した。
で の と こ ろ, bisphenolAの
bisphenol
Aの
抗 原 決 定基 の 特 対 す るモ
感 作性, 抗 原 決定 II.実
基, 他 の 抗 原 物 質 との 交 叉 反 応 性 に つ いて は十 分 に 明 らか に され て は い な い。
1.抗
そ こで, 本 研 究 はBis-GMAの
み な らず エ ポ キ
験 材 料 お よ び方 法
原
抗 原 に は, 2, 2-bis (4-hydroxyphenyl)
シ レジ ンの 構 成 成 分 で あ るbisphenolA (図1)
ane (bisphenolA,
BPA,
の感 作性, 交叉 反 応 性, さ ら に その 抗 原 決 定 基 と
の タ ン パ ク結 合 体,
な る構 造 を液 性 免 疫 誘 導 能 お よび抗 体 の 特 異性 を
有 す る2, 2-bis (4-hydroxyphenyl)
指 標 とし て 以 下 の 三 つ の実 験 を 設 け て検 討 した。
phenolB, IPP,
BPB,
proP
和 光 純 薬) , お よ び そ
な ら び にBPAと
類 似構 造を butane (bis-
東 京 化 成) , P-isopropylphenol
東 京 化 成) ,
diethylstilbestrol ( (DES,
なお, 歯 科 材 料 に よ る ア レ ル ギ ー はIV型 ア レル ギ ーで あ り, 感 作 リンパ 球 に よ って 媒 介 され る細胞
Aldrich) ,
性 免 疫 応 答 で あ るが, 感 作 成 立段 階 にお け る抗 原
和 光 純 薬) (図2)
提 示 細 胞 の 抗 原 の 取 り込 み,
を 用 い た 。 タ ン パ ク 結 合 体 の 作 製 に は, BPAを
リンパ 球 へ の抗 原 提
2, 4-dinitrofluorobenzene (DNFB, の そ れ ぞ れ の タ ン パ ク結 合 体
示 の 過 程 は液 性 免 疫 と 同一 の 過 程 を 経 る と考 え ら
ヘ ミサ ク シ ネ ー ト化 す る こ とに よ りカ ル ボ キ シ ル
れ る こ と か ら, bispheno1Aの
基 を 導 入 し, さ ら に カ ル ボ ジ イ ミ ド 法 でbovine
感 作 成 立 の判 定
serumalbumin (BSA)
は液 性 免 疫 誘 導 を 指 標 と し た 。1) bisphenolA
OVA)
単 体 を抗 原 と し て マ ウス に 投 与 す る ほ か, bisphenol
の リ ジ ン 残 基 の ε一ア ミ ノ 基( と 結 合 さ せ
た (図3)
A-タ ンパ ク結 合 体 を 作 製 し, これ を 抗 原
あ る い はovalbumin
。BPB,
IPP,
DESもBPAと
とし て用 い て マ ウス に 投与 し, そ の液 性 免 疫 誘 導
ヘ ミサ ク シ ネ ー ト化 し た 後,
能 を 調 べ た 。 ま た, 抗bisphenol
よ りBSAと
A抗
体産生に
同様 に
カ ル ボ ジ イ ミ ド法 に
結 合 さ せ た 。 な お, DNFBは
反応
お け る マ ウス の 系 統 差 に つ い て 検 討 し た 。 つ ぎ
性 に 富 む の で, 直 接dinitropheny1 (DNP)
に, 2) bisphenol
タ ン パ ク に 結 合 さ せ た 。 感 作 抗 原 と し て はBPA
Aの
交 叉 抗 原 として の 性 質 を
明 らか にす るた め に, BPAと
単 体,
共通 の 化 学 構 造,
お よ びBPA-OVA結
基を
合 体 (BPA-OVA)
す な わ ち 水 酸 基 を 置換 基 に もつ 一 つ あ る い は二 つ
を 用 い た 。 得 られ た 抗 体 の特 異 性 の 検 討 に は それ
の フ ェ ニル 基 や メチ ル 基 を 有 す る各種 低 分 子 物 質
ぞ れ のBSAと
(141)
の 結 合 体 で あ るBPA-BSA,
BPB-
442
口病 誌
平 成4年6月
bisphenol
A (BPA)
BPA
hemisuccinate
bisphenol B (BPB)
p-isopropylphenol (IPP)
diethylstilbestrol (DES)
BPA-protein
conjugates
図3BPA-タ
2, 4-dinitrofluorobenzene (DNFB)
図2
BPA関
ソパ ク結 合 体 の 調 製 方法
た 。 生 成 物 はKBr錠
連 化 合物 の構 造 式
剤 に し,
分 光 装 置 (Nicolet
FTIR
フ ー リエ 変 換 赤 外
20 DX)
に て,
収 ス ペ ク トル 分 析 を 行 い, BPAヘ BSA,
IPP-BSA,
OVAと
DES-BSA,
DNP-BSAを
用 い,
トの 確 認 を 行 っ た 。BPAヘ
の 交叉 反 応 を 回 避 した。
BPAの
方 法 に 準 じ た 。 す な わ ち, とsuccinic
anhydride
に, pyridine
合 さ せ た20) 。BSA (Fraction bulin-free,
BPA6.79 (25mM)
7.5g (75mM,
100mlを
の
Sigma)
和 光 純 薬)
anhydrideとpyridineを
mgを
マ ト グ ラ フ ィ ー (TLC)
サ ク シ ネ ー ト25mgを
plate (Silica
Gel
60F
254, Merck)
を 求 め た 。 次 に,
光 純 薬)
5m1に
carbodiimide
に添 加
置 後CMC10mgを
30
N-dimethylfor-
溶 解 し たBPAヘ
ミ ず
調 整 し た 。10分 間 放
加 え, 遮 光 し て 室 温 に て16
時 間 撹 搾 を 続 け 反 応 さ せ た 。Dulbeccoの
リン 酸
展 開 溶 媒 に 用 い た カ ラ ム ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー (SL
緩 衝 液 (PBS,
間透 析
licaGe160,
後, 沈 殿 を 遠 心 分 離 し (1, 500×9,
Merck)
酢 酸 エ チ ルを
Sigma)
連 続 撹 搾 し な が ら1滿
っ 添 加 し た の ち, pH5.5に
し, 酢 酸 エ チ ル で 展 開 し, 紫 外 光 下 に て 出 現 し た ス ポ ッ トのRf値
溶 解 し, 1-cy-
添 加 し た 。 さ ら に, N,
去 し た 。 生 成 物 を 分 離 同 定 す る た め に, 薄 層 ク ロ を 行 った 。 試 料 の一 部 を
glo-
ま た はOVA (gradeV,
metho-p-toluenesulfonate (CMC, 除
結
essentially
超 純 水25m1に
mamide (和
TLC
る い はOVAと V
clohexyl-3- (2-morpholinoethyl)
加 え て 溶 解 し, 85℃ に て
4時 間 反 応 さ せ た 。 次 に 生 成 物 をchloroformで 抽 出 し, succinic
Sigma)
50mgを
ミサ ク シ ネ ー
ミサ ク シ ネ ー トは カ
ル ボ ジ イ ミ ド法 に よ りBSAあ
ヘ ミサ ク シ ネ ー ト化 はWainerら19)
赤外 吸
で 生 成 物 を 分 離 した。 得 ら
れ た フ ラ ク シ ョ ン ご と にTLCを 値 を 示 す フ ラ ク シ ョン を 集 め,
行 い,
pH7.4)
に 対 し4℃
で3日 5min) ,
上清
を 分 注 し て 一30℃ に 凍 結 保 存 し, 実 驗 に 用 い た 。
同 じRf
ま た, BSA (分
溶媒を減圧留去 し
(142)
子 量69, 000)
1mg/ml,
0VA (分
口 病 誌1992,
子 量46, 000) 1mg/mlお
よ びBPA (分
50μg/mlの280nmに
子 量228)
を 測 定 し, BPAに
の2週
つ い て は モ ル 吸 光 係 数 を 求 め,
BPA-BSAlmg/mlあ
IPP,
He,
結合お
10m1に
α2Mホ
和 光 純 薬)
1.4m1に
100μ1をBSA溶
与 群 の2群
4.抗BPA抗
4-dioxane
て 希 釈 し,
マ ウ ス にOVA投
BPAま
この 希 ( 釈 溶 液
を 設 け, 一 群7匹
EIA)
体 をenzyme
PBSに
の 各 ウ ェ ル に50mM炭
360nmに
お け る ε-DNP-リ
を17, 530,
280nmに
な りを25%, し て, BSAの
ジ ンの モ ル吸 光 係 数
お け る ε-DNP-リ
BSAlmg/m1の0.D.28。
O.D.36。, O.D.280の
濃 度 を 算 出 し, BSAに
島 津 製 作 所)
9: 1あ る い は1: 2.実
1)
C3H/He,
4℃
を0.67と
で 一 夜 静 置 し, 固 相 化 し た 。 抗 原 溶 液 を 除 去 後,
よび
0.2%
結
調 製)
Sigma)
Tに
(
お よ び0.5%
を 含 むPBS (PBS-T,
て そ れ ぞ れ160倍
Tween20
pH7.4) ( 抗 体)
に て5 はPBS-
に 希 釈 し て, 50μ1ず
ウ ェ ル に 分 注 し, 室 温 に90分
つ各
静 置 後, PBS-Tで
2次 抗 体 と し てPBS-Tに
て4, 000倍 に 希 釈 し た ビ オ チ ン 化 抗 マ ウ スIgGヤ
を用 い た。 マ ウ ス は よ り購 入 し,
つ 分 注 し,
回 洗 浄 し た 。 マ ウ ス 抗 血 清 (1次
( ethanol
齢 の 雌 性 マ ウ ス (BAL
日 本 生 物 材 料 セ ン タ ー (東 京)
を100μ1ず
gelatin (Sigrna)
5回 洗 浄 し た 。 次 に,
C57BL/6)
pH9.6) とし
験動 物
実 験 動 物 に は6∼10週 B/c,
酸 緩 衝 液 (CBB,
Flow)
て10μ9/m1に
対 す るDNPの
を用 い た。
Assay-Plate,
に て 希 釈 し た 抗 原 溶 液BPA-BSA (BSA量
分 光 光 度 計 はUV-240
を 使 用 し, 溶 媒 はPBS:
ェ ル (マ イ ク ロ プ レ
ジ ソの 重
値 よ りDNPお
合 モ ル 比 を 求 め た 。 な お,
の
immunoassay
に よ り 測 定 し た 。96ウ
ー ト (Titertek (R) Immuno
間 透 析 し た 。PBS中
5回
免疫 し た マ ウ ス血
時 間 擬 搾 を 続 け な が ら 反 応 させ た 。 反 応 終 了 後, で3日
と し,
体 の測 定 法 た はBPA-OVAを
清 中 の 抗BPA抗
液 に 添 加 し, 遮 光 し て 室 温 で3
対 し4℃
C3H/
与 群, BPA-
免 疫 し, 同 様 に 抗 血 清 を 得 た 。
ウ 酸 緩 衝 液 (pH9.0)
溶 解 し た 。DNFB10μ1を1,
C57BL/6系
OVA投
よ び 結 合 モ ル 比 の 測 定 は 以 下 の よ うに 行 っ た 幻)。 BSA200mgを
の マ ウ スか ら全採 血 した 。血
間 放 置 後 血 餅 を 分 離 し, 抗 血 清 を
系 統 差 の 有 無 を 調 べ る た め, BALB/c,
対 す る結 合 モ
ル 比 も 同 様 に 求 め た 。DNFBとBSAの
行 った。 各回 の 免疫
に 凍結 保 存 して 以下 の実 験 に 供 した。
モ ル数 を 求
DESのBSAに
後 に 各 群5匹
443
得 た 。 抗 血 清 は サ ソ プ ル チ ュ ー ブ に 分 注 し-80℃
差 か らBSA
1モ ル あ た りに 結 合 し て い るBPAの
間 隔 で1∼4回
液 は 室 温 に1時
る い はBPA-OVAlmg/
mlとBSAlmg/mlのO.D.280の
め た 。BPB,
加 免 疫 は2週
お け る 吸 光 度 (O.D.280)
59/2
ギ 血 清 (American
1週
Qualex)
を 各 ウ ェ ル に100μ1
ず つ 入 れ, 室 温 で30分 反 応 さ せ た 。 さ ら に,
間 の 馴 化 期 間 を 設 け た 。 実 験 期 間 中 は, 室 温23± 2℃,
し た ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 標 識 ス ト レ プ トア ビ ジ ン
明 暗12時 間 周 期 の 環 境 下 で 飼 育 し, 固 形 飼
料CE-2 (日 3.免
本 ク レ ア)
マ ウ ス は 一 群25匹
与 群 お よ びBPA-OVA投 ethanol (9:
1)
お よ び1.4×10-2%H202を
に 溶 解 し濃 度1mg/ml
緩 衝 液 (pH5.4)
い はBPA-OVAを adjuvant (CFA,
等 量 のcomplete Difco)
マ ル ジ ョ ン を 作 製 し, μ1ず つ 足 蹠
25μ1を
る
洗 浄 し, 0.3%
含 む0.1Mク
Freund's
添 加 し,
反 応 を 停 止 さ せ,
(143)
マ イ ク ロプ にて
マ ウ ス の 系 統 差 を 調 べ る 実 験 に お い て は,
前述
測 定 した 。
と同 樣 にBPA-OVAをCFAと
腹 部 ・ 背 部 の 皮 下 に 注 射 した 。 追
つ入れ
後, 2NHC1
コ ロ ナ 電 気)
O.D.492-610を
に つ き 総 量50
エ ン酸
を 各 ウ ェ ル に100μ1ず
レ ー ト光 度 計 (MTP-22形,
と 混 和 し て, 均 一 な エ
マ ウ ス1匹
つ 入 れ, 室 温 に (
て5回
遮 光 し て 室 温 で 反 応 さ せ た 。15分
と し て1mg/m1 て 希 釈 し た 。BPAあ
に希 釈
o-phenylenediamine-dihydrochloride (Sigma)
と し, BPA投
与 群 を 設 け た 。BPA
と し た 。BPA-OVAはOVA量 に な る よ う にPBSに
て4, 000倍
を 各 ウ ェル に100μ1ず
30分 静 置 し た 。PBS-Tに
疫方 法
BALB/c系
はPBS:
Dako)
と 水 は 自 由 摂 取 させ た 。
洗 浄 後, PBS-Tに
PBS
-Tで5回
と もに2週
間隔
444
で5回
口病 誌
平 成4年6月
皮 下 投 与 し,
取 し たBALB/c,
5回 目 の 投 与 か ら2週
C3HIHe,
の 抗 血 清 をPBS-Tに 原BPA-BSAと
C57BL/6系
て160倍
希 釈 し,
反 応 さ せ, EIAに
後 に採
bovine
マ ウス
てO.D.492-610
第1病
IPP-BSA,
リク ロー ナ
91yco14000 (PEG,
各 抗 原 溶 液 をBSA量
とし
て 希 釈 し, 96
ウ ェ ル マ イ ク ロ プ レ ー トの 各 ウ ェ ル に100μ1ず 分 注 し て 固 相 化 し た 。BPA-OVAを5回 マ ウ ス 抗BPAポ
体 (抗 血 清)
10min)
をPBS-Tに
後, RPMIに し, RPMI/FBSを
て1回
遠 心 洗 浄 (250×9, 加 え 脾 細 胞 が5×106/
な る よ う に 調 製 し, 96ウ ェ ル マ イ ク ロ プ レ の 各 ウ ェ ル に100μ1ず
薬) , 4x10-7Maminopterin (Fluka)
希 釈 した もの
BPB-BSA,
DNP-BSAと
FBS (HAT培
を 測 定 し, そ
し た 。4日
目お よ び7日
にHAT培
地 よ りaminopterinを
DES-BSA, て0.D.492-61・
の 結 果 得 ら れ た 結 合 率bound/tota1 (B/T) 較 す る こ と に よ り, BPA関
を比
リク ロ ー ナ ル 抗 体 の 交 叉 反 応 性 を 検 討 し
た.Tは
抗 血 清 原 液 と 固 相 化 抗 原 と の 結 合 をEIA
に よ り求 め た 吸 光 度 と し,
よ り求 め た
BPA-OVA結
合 体 をCFAと
動 静 脈 よ り約50μ1の
目よ り
ハ イ ブ リ ドー マ を 維 持 し た 。
BSA,
用 い,
BPA-BSAを
1次 抗 体 に は コ ロ ニ ー
高 い 抗 体 価 を 有 す る 抗BPA抗
と
と も に2週
間隔で
目 の 免 疫 か ら2週
後 に尾
7。 抗BPAモ L鎖,
腹 腔 内投 与 し
Eagleのrninimum 日水 製 薬)
essential に て3回
medium
ブ ク ラ ス (IgG1,
お よ びL鎖 (IgLκ, Mouse
PharMingen)
スパ ーテ ル に て 脾 細胞 を 分 散 さ
MEM,
のIgGサ
clonal
後に 常法 に従 って無 菌 的 に
せ て,
ノ ク ロー ナ ル 抗 体 のlgGサ
ブ ク ラ ス,
力 価 お よび特 異 性
モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 (ハ イ ブ リ ド ー マ 培 養 上
よ り測 定
IgG3)
た 。 最 終 免 疫 の2日
の ク ロー
ニ ン グを 行 い モ ノ ク ロー ン と した 。
血 液 を採 取 した 。 血 清 を 分
対 す る 抗 体 価 をEIAに
体 を 産 生 して い る
ハ イ ブ リ ド ー マ に 限 界 希 釈 法 に よ る3回
て希釈した
清)
Immunoglobulin
IgG2a, IgLλ)
IgG2b, をMono-
Isotyping
を 用 い て 決定 し た。
Kit (
各 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 と 固 相 化 抗 原BPA-BSA と の 結 合 率B/T (%)
遠 心 洗 浄 (250×9, (
し, 脾 細 胞 浮 遊 液 を 調 製 した 。 あ ら か じ
めRPMI1640 (RPMI,
除 い たRPMI/
交 換 し た 。14日
よ り行 っ た 。 固 相 化 抗 原 に は
し, 高 い 抗 体 価 を 示 し た マ ウ ス に 最 終 免 疫 と し て
10min)
10日 目
定 と 同 様 にEIAに
BPA-OVA (1mg/mの0.2m1を
脾 臓 を 摘 出 し,
100μ1を
つ添加
地,
に 対 す る抗 体 を 産 生 し て い る ク ロ ー ン は 除 い た 。
マ ウ ス にOVA量
な る よ うにPBSに
5回 皮 下 注 射 し た 。5回
離 後, BPAに
目にHAT培
が 観 察 され た ウ ェ ル の 培 養 上 清 を 使 用 し た 。BSA ノク ロ ー ナ ル抗 体 の 作 製法
6週 齢 の 雌 性BALB/c系 し て1mg/m1に
が 入 っ たRPMI/
ハ イ ブ リ ド ー マ の ス ク リー ニ ン グ は 抗 体 価 の 測
吸光 度 とした 。 6.抗BPAモ
地)
RPMI/FBSで
Bは 各 希 釈 率 に お け る
抗 血 清 と固 相 化 抗 原 の 結 合 をEIAに
光純 お よ び1.6
地 う を 各 ウ ェ ル に100μ1ず
FBS (HT培
連 化 合 物 に 対 す る抗
BPAポ
つ 播種 し
た 。24時 間 後, 1×10-4Mhypoxanthine (和
リク ロー ナル 抗
て160倍
た 。1分 10min)
ー ト (Coster)
免疫 し
0.5m1にRPMI0.5
×10-5Mthymidine (Sigma)
反 応 させ た 。EIAに
な
上清
を 細 胞 ペ レ ッ トに 加 え, 細 胞 融 合22) を 行 っ
m1に
つ
Merck)
を 原 液 と し, 倍 々 希 釈 し, 固 相 化 抗 原BPA-BSA, IPP-BSA,
10に 後,
添 加 し, 37℃ に 保 温 し て お い た 溶 液 (50%
PEG)
DES-BSA
な る よ う にCBBに
たBALB/c系
と脾 細 胞 が1:
る よ う に 混 合 し 遠 心 (250×9,
m1を
BPB-BSA,
て10μ9/m1に
理 学 教 室 よ り供 与)
定 によ り
ル抗 体 の交 叉 反 応 性
お よ びDNP-BSAの
本学 医学 部
を 除 去 し た 。 加 温 し て 溶 解 し たpolyethylene
連 化 合 物 に対 す る抗BPAポ
BPA-BSA,
培 地 (RPMI/FBS)
腫 細 胞P3/X63-Ag8.U1 (P3U1,
有 意 差 の 検 定 を行 った 。 5.BPA関
Flow)
に て対 数増 殖 期 に な る よ うに培 養 した マ ウ ス骨 髄
固相 化 抗
を 測 定 し た 。 デ ー タ はStudentのt検
serum (FBS,
原 溶 液BPA-BSAを
日 水 製 薬) 十10%Feta1
培 養 上 清 の2倍
(144)
を 求 め た 。 す な わ ち, 抗 固 相 化 し, ハ イ ブ リ ド ー マ
希 釈 系 列 を 作 製 し て,
モ ノク ロー
口病 誌1992,
ナ ル 抗 体 とBPA-BSAを お い てEIAに B/Tが
反 応 さ せ,
445
各 希釈 率 に
てO.D.492-610。 を 測 定 し た.ま
約50%を
59/2
た,
示 す と きの 抗 体 希 釈 率 の逆 数 を
抗 体 価 と して 求 め た 。 さ ら に,
B/Tが80%に
な る よ う にPBS-Tに
て 希 釈 し た ハ イ ブ リ ド ー マ 培 養 上 清 を 用 い て, BPA-BSA,
BPB-BSA,
IPP-BSA,
DES-BSA,
DNP-BSAを200ng/ml∼200μ9/mlの 囲 で 希 釈 し,
濃 度範
この モ ノク ロー ナ ル抗 体 と遊 離 抗原
の 共 存 す る 溶 液 を,
BPA-BSAを
固 相 化 した マ ル
チ ウ ェ ル プレ ー トの 各 ウ ェ ル に50μ1ず
っ分注 し
図4BPAヘ
ミサ ク シ ネー トの 赤 外 吸 収 スペ ク トル分 折
て, 遊 離 抗 原 と 固 相 化 抗 原 を 競 合 させ た 。 各 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 に つ い て,
固 相 化 抗 原BPA-BSA
と モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 結 合 をEIAに 度 と し て 測 定 し た 。 抗BPAモ とBPA-BSAの
よ り吸 光
表1BPA関 BSA1モ
ノ ク ロー ナ ル抗 体
結 合 反 応 がBPA関
連 化 合 物一BSA結 合 体 にお け る ル に対 す る結 合 モ ル比
連 化 合 物-
タ ンパ ク結 合 体 に よ って受 け る阻 害 の程 度 を 比 較 す る こ と に よ り, 各 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 抗 原 特 異 性 を 検 討 した 。 皿.結
ル の 吸 収 が 認、 め ら れ,
果
確 認 し た (図4) 1.マ 1)
ウ ス に お け る抗BPA抗 BPAお
体 の 産生
よ びBPA関
Rf値
連 化 合 物 の タ ンパ ク
OVA)
せ,
BPB,
IPP,
DESは
直 接 タ ン パ ク (BSA,
と結 合 させ る こ とが で き な い た め,
ミサ ク シ ネ ー トを
。
が0.60の
精 製 物 (BPAヘ
ミサ ク シ ネ ー
ト) を カ ル ボ ジ イ ミ ド法 に よ りタ ン パ ク と結 合 さ
結合体 BPA,
BPAヘ
BSAお
BPA-OVA)
これ ら
よ びOVAと
の 結 合 体 (BPA-BSA,
が 得 ら れ た 。BSAお
ル に 対 す るBPAの
よ びOVA1モ
結 合 モ ル 比 は そ れ ぞ れ2.7,
の 化 合 物 を ヘ ミサ ク シ ネ ー ト化 し て カ ル ボ キ シ ル
α9で
あ っ た 。 同 樣 に, ヘ ミサ ク シ ネ ー ト化 し た
基 を 導 入 し,
BPB,
IPP,
さ ら に カ ル ボ ジ イ ミ ド法 に よ り タ ン
パ ク と結 合 させ た。 BPAの
媒 中 でsuccinic
反 応 さ せ,
Rf=0, が0.60,
接BSAと
EIAに
が0.60
の 部 分 か ら は 白 色 の 粘 性 を も つ 半 固 形 物3.29が 得 られ,
Rf値
得 ら れ た 。Rf値
が0.30か が0.60,
赤 外 吸 収 ス ペ ク トル 分 析 か ら,
あ っ た 。DNPは
そ の 結 合 モ ル 比 は3.7で
お よび フ ェ ニ
お い て 固 相 化 抗 原 また は 遊 離 抗 原 と し
DES-BSA,
合 体 が 作 製 され た 。
DNP-BSA結
マ ウ ス に お け る 抗BPA抗 マ ウ ス にBPA単
合 体 をCFAと
回 皮 下 注 射 し,
(145)
あ
お よび
BPB-BSA,
OVA結
直
。
BALB/c系
精製物の
カ ル ボキ シ ル基 と
エ ス テ ル 結 合 の カ ル ボ ニ ル の 吸 収,
16.6で
その 結 合 モ ル比
て 使 用 す るBPA-BSA,
2)
ら は 白 色 の 固 形 物1.79が お よ び0.30の
結 合 体BPB-BSA, 得 ら れ,
感 作 抗 原 と し て 使 用 す るBPA-OVA,
に 対 し, Rf値 (
ス ポ ッ トが 現 れ た 。Rf値
2.3,
結 合 させ,
っ た (表1)
て 分 離 し た と こ ろ, BPA
92) , pyridine (Rf=68) 0.30の
anhydride
そ の生 成物 を酢 酸 エチ ルを 展
開 溶 媒 に 用 い たTLCに
DESとBSAの DES-BSAが
は そ れ ぞ れ5.9,
ヘ ミサ ク シ ネ ー ト化 に お い て は, BPA
6.79をpyridine溶 乞59と
IPP-BSA,
IPP-BSA,
体の産生 体 ま た はBPA-
と も に2週
各 投 与 か ら2週
間 隔 で1∼5
間 後 に採 取 した血
446
口病 誌
平 成4年6月
図6抗BPA抗 図52週
間隔 で1∼5回
系 マ ウ スの 抗BPA抗
体 産 生 に お け る マ ウ ス の系 統 差
抗 体価 は抗BPA抗 体 をEIAに 吸光 度 (0。D、492-610) を 表す
免 疫 を 行 ったBALB/c 体 産 生 の変 化
C57BL/6,
C3H/He系
ら れ な か っ た が,
マ ウ ス間 に 有 意 差 は 認 め
BALB/c系
マ ウ ス もBPAに
清 中 のIgG抗BPA抗 体 の 抗 体 価 の 経 時 的 変化 は図5に 示 す ご と くで あ る。BPA単 体 投与 群 で
対 し 高 応 答 性 を 示 し た (図6)
はCFAと
ともに5回 注 射 して も全 経 過 に お いて
BALB/cお
抗BPA抗
体 の 産 生 は認 め られ なか った 。 これ に
体 が 誘 導 され,
対 しBPA-OVA結
合 体 をCFAと
BPA-OVA結
と もに マ ゥ ス
は, 抗OVA抗
マ ウ ス の 抗BPA抗
体産生
リ ク ロー ナ ル 抗 体 のBPA関
BPA-OVA結 で5回
交 叉 反 応 し な い た め, 固相 化 抗 原 に 用 い たEIAで
ま た,
マ ウ ス に 抗BPA抗
連化合
物 に対 す る交 叉 反 応 性
免 疫 で は 高 い抗 体 価 を 維 持 して い た。 なお, OVA とBSAは
よ びC3H/He系
2.抗BPAポ
体 価 の 上 昇 が認 め られ, そ れ 以後 の 追 加
BPA-BSAを
。
合 体 投 与 に よ りC57BL/6,
に は系 統 差 が 存 在 し てい た 。
に投 与 した 群 で は, 2回 の 投 与 以 降 か ら抗BPAOVA抗
て測 定 した と きの
体
合 体 をCFAと
と も に2週
皮 下 投 与 し たBALB/c系
れ た 抗 血 清 を 抗BPAポ
間隔
マ ウスか ら得 ら
リク ロー ナ ル抗 体 として
の反 応 は回 避 され て い る の で, 抗BPA-OVA抗
使 用 し た 。BPA関
体 を 以 後 は抗BPA抗
叉 反 応 性 を 調 べ る た め に, BPA-BSA,
BPB-BSA,
IPP-BSA,
マイ クロプ
BPA-OVA結
体 と して扱 った 。
合体 投 与 に よ るマ ウス の抗BPA
DES-BSA,
連 化 合 物-BSA結
DNP-BSAを
合 体 との交
抗 体 産 生 に お け る 系統 差 を 明 らか にす るた め に,
レ ー トに 固 相 化 し,
主 要 組 織 適 合 遺伝 子複 合体 の ハ プ ロタイ プの 異 な
リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 各 希 釈 系 列 と の 結 合 率B/T
るマ ウス の3系 統 にBPA-OVA結
合 体 をCFA
%)
をEIAに
こ の 固 相 化 抗 原 と抗BPAポ
よ り測 定 し た と こ ろ, BPB-BSA, (
と と もに2週 間隔 で5回 皮 下 投 与 し, 5回 目の 投
IPP-BSA,
DES-BSAはBPA-BSAと
ほぼ同一
与 か ら2週 間 後 に 得 られ た 抗 血 清 の 抗BPA抗
の 反 応 曲 線 を 描 い た (図7)
。 こ の こ と は, 抗
価 を 比 較 し た 。 抗BPA抗
体
BPAポ
体 産 生 は, C57BL/6
系 マ ウ ス に比 較 してC3H/He系
IPP,
DESと
交 叉 反 応 す る こ と を 示 し て い る 。 ま た, DNP-
マ ウ ス は5%の
危 険 率 で 有 意 に低 か った 。BALB/c系
リク ロー ナ ル 抗 体 はBPB,
BSAに
マ ウス と
(146)
対 して も 弱 い結 合反 応 が 認 め られ た 。 な
口 病 誌1992,
表2抗BPAモ 1,
59/2
447
ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体mAb (A B3,
C8,
ク ラ ス,
F1,
H8)
のlgGサ
抗 体価 はBPA-BSAと の結 合 率B/Tが 示 す と きの抗 体 希 釈 率 の逆 数で あ る
図7抗BPAポ
リ クロ ー ナ ル抗 体 とBPA関
プ
L鎖 お よ び 抗 体 価
約50%を
連化
合 物 との 結 合 率B/T
Tは 抗 血 清 原 液 と固 相 化 抗原 の 結 合, Bは 各 希 釈 率 にお け る抗 血 清 と 固相 化 抗 原 の結 合 をEIAに り求 め た 吸 光 度 (0.D.192-610)
よ 図8抗BPAモ
お,
陰 性 コ ン ト ロ ー ル と し て 用 い たBSAと
応 は 全 く認 め ら れ な か っ た 。B/T値
の反
が50%を
B3,
ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体mAb (A1, C8,
F1,
H8)
とBPA--BSAと
の
結 合 率B/T
示
す 抗 体 希 釈 率 の 逆 数 で 比 較 す る と, BPAが25.6, BPBが21.1,
IPPが27.8,
の に, DNPは3.0で 抗BPAポ
DESが30.0で
ある
あ った 。
リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 はBPA関
の ク μ 一 ニ ン グ を 経 て, 五 つ の ハ イ ブ リ ドー マ が
連化合
物 と も 結 合 し, 交 叉 反 応 性 を 示 し た 。 3.抗BPAモ ス, L鎖, 抗BPAポ
得 ら れ,
ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 のIgGサ 力 価 お よび 抗 原 特 異 性
3,
リク ロ ー ナ ル 抗 体 のBPA関
各 ハ イ ブ リ ドー マ の 産 生 す る モ ノ ク ロ ー
ナ ル 抗 体 (ハ イ ブ リ ド ー マ 培 養 上 満)
ブクラ
C8,
F1,
Monoclonal
連化合
物 に 対 す る 交 叉 反 応 性 が 高 い 場 合 に は, BPAの
pingKitを
抗 原 決 定 基 の 構 造 が 決 定 で き な い た め,
IgGサ
抗BPA
モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 作 製 し た 。BPA-OVAを CFAと
と も に2週
ら にBPA-OVAを
間 隔 で5回
1,
皮 下 に 免 疫 し, さ
2b,
C8,
各 モ ノ クP一
抗BPAモ BPA-BSAと
H8がIgG1で,
(147)
ナ ル抗 体 の A
B3とF1はIgG 型 で あ っ た (表2)
。
ノ ク ロー ナ ル抗 体 と固 相 化 抗 原 の 結 合 率B/T (%)
を 各 希釈 率 ご と
に 求 め て 反 応 曲 線 を 作 成 し た (図8)
3回
Isoty-
を 調 べ た と こ ろ,
L鎖 は い ず れ もIgGLκ
腹 腔 内 投 与 し たBALB/c系
液}こ て 融 合 し,
用 い て,
B
した 。 Immunoglobulin
ブ ク ラ ス お よ びL鎖
マ ウ ス の 脾 細 胞 と マ ウ ス 骨 髄 腫 細 胞P3U1を50 %polyethyleneglyco1溶
H8と Mouse
をA1,
.BPA-BSA
448
口病 誌
平 成4年6月
mAb (A1)
mAb (B3)
mAb (C8)
mAb (H8)
mAb (F1)
図9各
モ ノ クロ ーナ ル 抗 体mAb (A1, B 3, C8, F1, H8) と固 相 化 抗原 BPA-BSAの 結合反応 に対 す る遊離抗原 BPA-BSA, BPB-BSA, IPP-BSA, DESBSA,
(148)
DNP-BSAの
阻害
口 病 誌1992,
表3抗BPAモ 対 す るBPA関
と約50%結 ら 求 め,
ノク ロー ナル 抗 体 と固 相化 抗 原BPA-BSAの 連 化 合 物一BSA結 合 体 の50%阻 害 値
そ の 逆 数 を 抗 対 価 と し, 表2に
示 した 。
29で 最 も 抗 体 価 が 高 く, 続 い てC8が27, H8が26, お,
B3が24で
H8が
F1と
最 も低 か っ た (表2)
1,
ル ー プ はB3グ
B3,
C8,
。 ま た,
2.90で,
BPA-BSAの
比 較 しBPB-BSAに
害 の 程 度 が 弱 か っ た 。IPP-BSA, %阻
競合反応か
対 比 はA1が
そ れ ぞ れ5。1, 3.6,
ら, 各 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 に つ い て, 置 換 曲 線 を
C8が3.3,
3.8,
作 製 し た (図9)
3、8と ほ ぼ 等 し い 相 対 比 を 示 し た 。
遊 離 抗 原BPA-BSA,
IPP-BSA,
DES-BSA,
DNP-BSAの
。 い ず れ の モ ノク ロー ナル 抗 体
も低 濃 度 のBPA-BSAに け て い た 。BPB-BSA,
IPP-BSA,
B3,
BPAの
F1,
B3が8.9,
5.9,
ブ ク ラスお よび 抗 原特 異 性 の ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 (A1, H8)
が得 られ た 。 いず れ の
モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 に お い て も, IPP-BSA,
抗 原 決 定 基 に は 水酸 基 を置 換 基 に もつ フ
BSA,
ま た, BPA関 か ら, A1,
BPAモ
H8の
グ ル ー プ とB3,
の グ ル ー プ に 大 別 され た 。 す な わ ち, プ はBPB-BSA,
IPP-BSA,
A1グ
DES-BSAに
はIPP-BSA,
DES-BSAと
ルー
ル ープ
IV.考
察
比 較 しBPB-BSAに
1)
H8と
固 相 化 抗 原BPA-
の 結 合 反 応 に 対 す るBPAお
関 連 化 合 物 一BSA結
抗 原 決 定 基 に は, 水 酸 基 を 置 換 基 に もつ
った。
A1,
F1,
ほ と ん ど 阻 害 し な か っ た こ とか ら,
フ ェ ニ ル 基 が 深 く関 与 し て い る こ とが 明 ら か と な
1.マ
C8,
抗
BPAの
よ る 阻 害 は 弱 くな っ て い る 。 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 B3,
DES-
F1
ほぼ 同
程 度 の 阻 害 を 受 け て い る の に 対 し, B3グ
固 相 化 抗 原BPA-BSAと
ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 結 合 を 阻 害 し た が,
DNP-BSAは
連化合物 に 対する反応パ ターン C8,
BPB-BSAは
6.5,
H8が5.1,
よ る 結 合 阻 害 は ほ と ん ど 認 め ら れ ず,
ェ ニ ル 基 が 深 く関 与 し て い た 。
BSAと
C8,
よ る阻
害 値 に 対す る相
F1が7.8,
異 な る 五 つ の 抗BPAモ
DES-BSAに
対 し て も 中 等 度 の 阻 害 を 受 け て い る が, DNPBSAに
害 値 のBPA-BSAの50%阻
以 上 よ り, IgGサ
よ り強 い結 合 阻 害 を 受
10で
DES-BSAの50
BPB-BSA,
BPA-BSAと
A1グ
害 値 に 対 す る 相 対 比 は そ れ ぞ れ4。9,
あ り, H8はA1と
F
あ
H8のBPB-BSAの50
%阻 害 値 は そ れ ぞ れ1.43,
に 対 す る 固 相 化 抗 原
C8,
ル ー プ に 比 較 し50%阻
ル ー プ の 中 で も, A1,
50%阻
A1,
F
0.28μ9/wellで
害 値 が 大 き な 値 を 示 し た (表3)
は 全 く反 応 し な か っ た 。
H8 (B/T=80%)
0.21,
よび
モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 の 抗 原 特 異 性 を 検 討す るた め に, モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体A1,
0.16μ9/we11,
そ れ ぞ れ0.29,
り, A1グ
害 値 はB3,
。な
い ず れ の モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 もOVAお
BSAと
1が そ れ ぞ れ0.17,
ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 中 でA1が
449
結 合に
か ら 求 め た 。BPA-BSAの5096阻
合 す る ときの 抗 体 希 釈 率 を 反 応 曲線 か
5個 の 抗BPAモ
59/2
合 体 の50%阻
ウス に お け る抗BPA抗 BPAタ
体 の 産生
ンパ ク結 合体
歯科 材料 が ア レ ルギ ー反応 を生 じるた め に は ま
よ びBPA
ず 歯 科 材 料 が 抗 原 と な る 必 要 が あ る が, 歯 科 材 料
害値 を 置換 曲線
(149)
450
口病 誌
平 成4年6月
そ れ 自 体 は 多 く の 場 合 ハ ピ テ ン で あ り, 単 独 で は
合 モル 比 は 各 ハ プテ ン-キ ャ リア ー 結 合 体 ご とに
抗 原 性 を 示 さず,
決 ま って い る もの の, そ の 範 囲 は比 較 的 広 い こ と
生 体 成 分 (キ
ャ リ ア ー)
と結合
して 初 め て抗 原 性 を 示 す と考 え られ て い る 。 この
が 知 られ て い る。 本 実 験 に お い て 用 い たBPA-
よ うな 場 合 に は, ハ プ テ ン単 体 と と も に 化 学 的 手
OVA結
法 でBSAま
比が 小 さ くて も感 作 性 が 高 く, ヘ ミサ クシ ネ ー ト
た はOVAと
結 合 さ せ た ハ プ テ ン-
合 体 に 関 して はOVAに
対 す る結 合 モル
キ ャ リア ー結 合 体 につ い て の 感 作性 試験 が 行 わ れ
化 され たBPAが
て い る。
と結 合 す る際 に は有 効 な立 体 配 位 を と る もの と思
ハ プ テ ソ を 高 分 子 に 結 合 さ せ る 場 合,
ハプテン
キ ャ リア ー とし て 用 いたOVA
われた。
に遊 離 の カ ル ボキ シ ル基 が ない ときに は あ らか じ
現 在 ま で の と こ ろ, BPAが
ハ プ テ ソ とし て体
め カ ル ボ キ シ ル 基 を 導 入 し て お く必 要 が あ る 。 本
内 に 入 っ て きた ときに そ の キ ャ リア ー の役 割 を 果
実 験 で はBPAの
水 酸 基 と ヘ ミサ ク シ ネ ー トエ ス
た す 物 質 が何 で あ る のか は十 分 に 明 らか に され て
テ ル を 形 成 させ,
カル ボ キ シル基 を導 入 した 。
い な い が, 生 体 内 に は多 くの 種 類 の タ ンパ クが キ
Pyridine溶 drideを
媒 中 でBPAとsuccinic
モ ル 比1:
ャ リア ー とな り うる と考 え られ て い る。
anhy-
3の 割 合 で 反 応 させ,
そ の生
行 っ た 結 果, BPAの
2)
マ ウスの 抗BPA抗
体産生の検討
スポ
化 学 物 質 の 感作 性 を 調 べ る場 合, ハ プ テ ン とな
ッ トは 認 め ら れ ず,
BPAは
そ の ほ と ん どが 反 応
る可 能 性 の あ る化 学 物 質 の 感 作 性 試 験 に は小動 物
し て い た 。BPAを
ヘ ミサ ク シ ネ ー ト化 す る 場
が用 い られ て い る。 本実 験 で は免 疫 学 的 知 見 の 蓄
成 物 に つ い てTLCを
合,
そ の 反 応 部 位 はBPAの
1モ
ル にsuccinic
は,
2モ ル 結 合 す る こ と に な る 。TLCに
BPAを
水 酸 基 な の で,
anhydrideは1モ
ル,
BPA
積 が 多 く, しか もモ ノク ロー ナ ル抗 体 の作 製 に利
あ るい
用 され るマ ウス を用 い た。 ま た, 投与 経 路 は臨 床
お い て,
酢 酸 エ チ ル で 展 開 し た 場 合, Rf値
適用 方法 が 理 想 で あ る が, BPAの
感 作 性 につ い
て はす で に臨 床 報 告 が あ り, 本 研 究 で は抗 原 決 定
は0.92
で あ った 。 カル ボ キ シ ル 基 な どの親 水 性 基 を 有す
構 造 の決 定 な ど, BPAの
る 化 合 物 で は 展 開 が 遅 れ, Rf値
研 究 の 主点 を 置 き, 皮 下 投 与 法 を 採 用 した。
で, Rf値
が0.60お
れBPA1モ
が 小 さ くな る の
よ び0。30の 生 成 物 は, そ れ ぞ
ル にsuccinic
結 合 し た 化 合 物 と2モ
anhydrideが1モ
抗 原 とし ての 特 異 性 に
感 作 成 立 の 有無 を 調 べ る 方 法 に は 細 胞性 免 疫
ル
能, 液 性 免疫 能, マ ク ロ フ ァー ジ機 能, ア レルギ ー反 応 を 指 標 とす る 多 くの 試 験 が あ る23)。 本 研究
ル 結 合 した 化合 物 と考 え ら
の 予 備 的 試 験 に お い て は 細胞 性 免 疫 能 に 関 す る リ
れ た。 本 実 験 に お い て は, BPA1モ cinicanhydride1モ
ンパ 球 幼 若 化 試 験 を 行 った 。BPA-OVA結
ル に 対 し てsuc-
をCFAと
ル が エ ス テ ル 結 合 し たBPA
合体
ともに 足蹠 に注 射 し, 所 属 リンパ 節 で
ヘ ミサ ク シ ネ ー ト を カ ル ボ ジ イ ミ ド 法 に よ り
あ る膝 窩 リンパ節 を 採 取 し, そ の リンパ 節 細 胞 を
BSAあ
BPA, OVAま た はBPA-OVAと と もに培 養 して 3H] thymidineの 取 り込 み を 測 定 した と ころ [
る い はOVAと
BPA-OVAを BPA関
結 合 さ せ,
BPA-BSA,
作 製 して 抗 原 と し て 用 い た 。 また 連 化 合 物 のBPB,
IPP,
OVAに
DESもBPAと
対 す る 反 応 が 強 く, BPAに
特 異 的 な反
同 様 に ヘ ミサ ク シ ネ ー ト化 し た の ち カ ル ボ ジ ィ ミ
応が 検 出で き な か った (未 発 表 デ ー タ) 。 ま た,
ド法 に よ りBSAと
歯 科 材料 に よ る ア レ ル ギ ー はIV型 ア レ ルギ ーで あ
DNFBは OVAに た が, DNPの
結 合 さ せ た 。 こ れ に 対 し て,
直 接DNP基 対 す るBPAの BSAに
をBSAに
対 す るBPA,
結 合 モ ル 比 は 平 均6.2で
り, 感 作 リ ンパ 球 に よ って 媒 介 され る細 胞 性 免 疫
結 合 させ た 。
結 合 モ ル 比 は0.9で BPB,
IPP,
応 答 で あ る が, 感 作成 立 段 階 にお け る抗 原 提 示 細
あっ
胞 の 抗 原 の 取 り込み,
DES,
リンパ 球 へ の 抗 原 提 示 の 過
程 は液 性 免疫 と同一 の過 程 を 経 る と考 え られ る こ
あ った 。 一 般 に,
ハ プ テ ン に 対 す る 免 疫 応 答 を 起 こす の に 適 し た 結
とか ら, bisphenol
(150)
Aの
感 作 成 立 の判 定 は 液性 免
口 病 誌1992,
疫 誘 導 能 を 指 標 と し, 抗BPA抗
体 産生の検討を
devittら24)
は,
L-ala--poly-L-lys [ (T, (
行 った 。本研 究 で は マ ウスにBPAあ る い はBPAOVAを 投 与 す る とき, 被 験 物 質 の 抗 原 性 を高 め
A-L]
る働 きを もっCFAを
に 連 鎖 し, ハ プ ロ タ イ プH-2b,
G) -
に 対 す る 近 交 系 マ ウ ス の 免 疫 応 答 はMHC
型 ア レ ル ギ ー反 応 を 起 こ しや す い モ ル モ ッ トを用 い た感 作性 試 驗 に お いて, BPAと と もにCFAを
DNFB接
投与 し た に もか か わ らずBPAの
2以
感 作 性 は 陰性 で
451
合 成 ポ リペ プ チ ド 抗 原 のpoly-
tyr, glu) -poly-D,
投与 した 。 小 動 物 の 中でIV
59/2
H-2d,
に 高 い こ と を 明 ら か に し た 。 一 方, 触 過 敏 症 のIr遺
H-2kの
順
石 井 ら25) は
伝 子 はH-2お
よ びH-
外 の遺 伝 子 に よる二 重 の 支 配 を受 けて い る こ
あ った とい う報 告 を 踏 ま え, マ ウス に 対 し て は
と を 報 告 し た 。 本 実 験 に お い て, 近 交 系 マ ウ ス に
BPA-OVAの
BPA-OVAを
投 与 回 数 を5回
与 す る際 に は毎 回CFAを BALB/c系
に 増 や し, ま た投
使 用 した 。
マ ウス にBPA単
もに5回 皮 下 投 与 して も抗BPA抗
体 をCFAと
対 す る抗
体 産 生 は マ ウ ス の 系 統 に よ り 異 な り, C57BL/6
と
H-2b) ,
体 産 生 は認 め
られ なか っ た が, BPA-OVA結
投 与 し た 場 合, BPAに
BALB/c (H-2δ) ,
順 に 抗BPA抗
合 体 をCFAと
C3H/He (H-2k)(
体 産 生 が 高 く, BPAに
遺 伝 子 はH-2に
の
対 す るIr
連 鎖 して い る 可能 性 が示 唆 され
と もに皮 下 投 与 す る と抗 体 価 の 上 昇 が 認 め ら れ
た 。 しか し, H-2以
た 。 す なわ ち, BPAは
い る か ど うか は 明 ら か で は な く, さ ら にH-2コ
単 体 で は マ ウ スに抗 体 産
外 のIr遺
伝 子 に も連 鎖 し て
生 を 誘 導 で きな い が, タ ンパ ク と結 合 した 場 合 に
ン ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス や リコ ン ビ ナ ン トマ ウ ス を 用
は, 強 い 免 疫 原 性 を 獲 得 す る こ とが 明 らか とな っ
い た 解 析 が 必 要 で あ る。 マ ウ ス に お い て 疾 患 の 発 症 とH-2と
た 。 また, 追 加 免 疫 以 降 は高 い 抗 体 価 を 維持 して いた 。BPA-OVA結
合体 をCFAと
投 与 し た 場 合, BPA量 つ き, 0.1ngと
と もに50μ1
の 間 に密
接 な 関 係 が 存 在 す る こ とが 明 ら か に され て い る 。 ヒ トの ア レ ル ギ ー 性 疾 患 に お い て も, 花 粉 症 や 喘
は 計算 上, マ ウ スー 匹 に
きわ め て 少量 な の で, ご く微 量 で
息 の よ うに 疾 患 感 受 性 とHLAと
の 相 関が 明 らか
も連 続 的 に投 与 され, か つ タ ン パ ク と結 合 しや す
に さ れ て い る も の も あ る が,
い 状態 に あ る場 合, た と え ば 紫 外線 照射 に よ る
に よ る接 触 過 敏症 は職 業 性 に 発 症 す る 場 合 が 多
BPAの
く, 遺 伝 的 な 解 析 を 行 うの は 難 し い も の と思 わ れ
フ リー ラジ カル 形 成 等 に お い て は感 作 が
る。
成 立 し うる も の と思 わ れ た 。 本 研 究 に よ り, BPA の み な らずBPAの
誘 導 体, あ るい はBPAが
2.抗BPAポ
構
れ る可 能 性 が 示 唆 され た。 BPA-OVA結 BPA抗
リク ロ ーナ ル 抗体 のBPA関
連化合
物 との交 叉 反 応 性
成 成 分 として 入 っ て い る化 合 物 に よ って も感 作 さ
3)
エ ポ キシ レジ ンな ど
抗 原 抗 体 反 応 の 測 定 に は, 疫 電 気 泳 動,
合 体 投 与 マ ウス に お け る抗
EIA)
体 産生 の 系統 差
ゲ ル 内 沈 降 反 応,
放 射 性 免 疫 測 定 法,
免
酵 素 免疫 測 定 法
な ど が あ る 。 ゲ ル 内 沈 降 反 応,
免疫 電 気 (
泳 動 は 広 義 の 沈 降 反 応 で あ り, タ ン パ ク 抗 原 の よ
生 体 の 抗 原 に対 す る免 疫 応 答 はそ の 個 体 の もっ 免疫 応 答 遺 伝 子 (lr遺 伝 子) に よ って遺 伝 的 に規
う な 可 溶 性 で 多 価 の 抗 原 と抗 体 と が 反 応 し て 格 子
定 され て い る。 近 交 系 マ ウ ス は 個体 間 の遺 伝 的ば
状 の 結 合 物 を 生 成 し 沈 殿 す る 反 応 で, 抗 原 決 定 基
らっ き に よ る影 響 を ほ とん ど受 け な い こ とか ら 免
が 限 られ てい る ハ プテ ソに は 適 し て い な い 。 一
疫 系 の遺 伝 解 析 に 利 用 され て い る。
方, EIAは
ハ プ テ ン に も 適 用 で き, 抗 体 あ る い
は抗 原 の標 識 に放 射 性 同位 元 素 を用 い ず に 酵 素 を
同種異 系移 植 に 際 し, そ の 適 合性 を 決定 す る遺 伝 子 領 域 は 主 要 組 織 適 合 遺 伝 子 複 合 体 (MHC)
用 い る も の で,
と呼 ば れ て い る。 マ ウス で は第17染 色 体 上 に位 置
が で き る 。Kitagawaら26)
す るH-2,
は, 抗 生 物 質 の バ イ オ
マ イ シ ン とそ の誘 導 体 に 対 す る抗 バ イ オ マ イ シ ン
ヒ トで は第6染 色 体 上 に 位 置 す るhu-
manleukocyteantigen (HLA)
同 時 に 多 数 の検 体 を 処理 す る こ と
抗 血 清 の 交 叉 反 応 性 をEIAに
で あ る。Mc(151)
よ り検 討 し た 。 そ
452
口病 誌
平 成4年6月
の結 果, バ イ オ マ イ シ ン誘 導 体 の 反 応 曲線 は交 叉
た が って, BPAに
性 の低 い 誘 導 体 で もバ イ オ マ イ シ ンの 反 応 曲 線 と
症 状 を 呈 した こ との あ る患 者 にDESを
平行 性 を 示 し, EIAで
場 合 に は, DESに
求 め た 交 叉 反 応 値 は抗 原
濃 度の 影 響 に よ る変働 が 少 な く, EIAが
交叉 反
応 値 の 測 定 に 有 用 で あ る こ とを 報 告 した 。 BPAお
よびBPA関
連 化合 物 の タ ンパ ク結 合
体 につ い て 分 子 構造 を比 較 し た 場 合, BPB, はBPAと
基 に, IPPで
投与 した
よ る ア レル ギ ー 症 状 が 発 現す
る 可能 性 が 考 え ら れ る。 ま た逆 に, DESに
対す
る ア レルギ ー患 者 にBPAも
誘導
し くはBPAの
体 が 適 用 され た 場 合 に も ア レル ギ ー症 状 が 惹 起 さ れ る 可能 性 が 考 え られ る。
IPP
3.抗BPAモ
同 様 に ヘ ミサ ク シ ネ ー ト化 し, BSA
と結 合 させ た の で, BPBで
す で に 感 作 され, ア レル ギ ー
ノクローナル 抗 体 の 特 異 性 お よ び
BPAの 抗原決定構造 一般 に, 多 価 の 抗 原 で は 得 られ た抗 体 の 交 叉反
は メチ ル 基 が エチ ル
は フ ェ ニ ル基 がHに 置 き換 って い る
点 がBPA-BSAと の 相 違 点 で あ る。合 成 卵 胞 ホ ル モ ン の 一 種 で あ るdiethylstilbestrol (DES)
応 性 が 高 く, 詳 細 な 抗 原 決 定 基 の 解 析 は難 しい と
は 炭 素 間の 二 重 結 合 が あ る もの の, フ ェニ ル基 や
され て い る。 最 近 で は抗 原 特 異 的 な モ ノ ク ロー ナ ル抗 体 が 作 製 され, 抗 原 決 定 基 の 解 析 に 利 用 され
メ チ ル構 造 を もち, BPAと
る よ うに な って きた28)。
構 造 が 類 似 して い る 。
BPAお
よびBPA関
連 化 合 物 一BSA結
BPAポ
リク ロー ナ ル抗 体 と の 結 合 をEIAに
測 定 した と ころ, 抗BPAポ
合 体 と抗
分子 量 が わ ず か に228し か な く, 単純 な 化学 構
て
造 を もっBPAに
リ ク ロー ナ ル抗 体 は
これ ら3種 類 の 化 合 物 と もBPAと
BPA関
ほ ぼ 同一 の 曲
対 す る ポ リク ロー ナル 抗 体 は
連 化合 物 と も交 叉 反 応 性 を 示 し, 抗BPA
ポ リク ロー ナ ル抗 体 とBPA関
線 を 描 き, 抗BPAポ リク ロ ーナ ル抗 体 はBPB, IPP, DESと 交 叉 す る と ころ が 明 らか とな った。
か ら はBPAの
した が って, BPAと
ナ ル抗 体 を 作 製 し, EIAに
で きな か った 。 そ こでBPAに
は 別 の 化 合 物 で も, これ と
共 通 の 化 学 構 造, あ るい は類 似 の 立 体 構 造 を 有す
離 抗 原 の 競 合 反応 か らBPAの
る な らぽ 交 叉 性 を示 す もの と思 わ れ る。
を 行 った 。
Fregertら27) はDESに
連 化 合 物 との反 応
抗 原決 定 基 を 明 らか にす る こ とは
ア レル ギ ー症 状 を 呈す
得 られ た 五 つ の 抗BPAモ
る患 者 に パ ッチ テ ス トを 行 い, BPAや
その他の
対 して, 遊 離 抗 原BPB-BSA,
関 連 物 質 に 対す る 反 応 性 か ら, DESと
交 叉 反応
BSAは
対 す る モ ノク ロー よ り 固 相化 抗 原 と遊 抗原決定基の解析 ノ ク ロー ナ ル抗 体 に IPP-BSA,
固 相 化抗 原BPA-BSAと
DES-
競 合 し, そ の反
性 を 示 す た め の 構 造特 異 性 につ い て, 二 つ の フ ェ ニル 基, フ ェニ ル基 を結 ぶ 炭 素 鎖, お よび 一 つ 以
応 曲線 はい ず れ の モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 に お い て も
上 の 水 酸 基 が 必 要 で あ る と報 告 して い る。 本 実驗
固 相 化 抗 原BPA-BSAと の 結 合 反応 は遊 離 抗 原 BPA-BSAに よ って 強 い 阻 害 を 受 け た が, 遊 離抗
にお い て は, 抗BPA抗 合 して い るIPPと
平 行 性 を 示 した 。抗BPAモ
体 は 水酸 基 が エ ス テル 結
交 叉 した 。した が って, 炭 素 原
原DNP-BSAで
ノ ク ロー ナ ル抗 体 と
は ほ とん ど阻 害 を 受 けな か った
子 を 中 心 と した 二つ の フ ェニ ル基, お よび 水 酸 基
こ とか ら, BPAの
な い し水 酸 基 が エ ス テ ル結 合 し た 化 合 物 はBPA
置 換 基 に もっ フ ェニ ル基 が 深 く 関 与 し て い た 。
やDESの
Leeら29) はinhibition
DESは
交 叉 抗 原 とな りうる もの と思 わ れ る。 エ ス トロゲ ン活 性 を 有 す る 合 成 卵 胞 ホ ル
け るhuman
serum
抗 原 決 定 構 造 に は, 水 酸 基 を radioimmunoassayに albuminに
お
対 す るペ ニシ リ
モ ンで, 前 立 腺 癌 の ホ ル モ ン療 法 な どに 用 い られ
ン の結 合 モ ル比 の 影 響 を 検 討 し, タ ンパ ク に対 す
るほか, 皮 脂 分泌 抑 制 作 用 が あ り, ふ け と り, に
る ハ プ テ ンの 結 合 モ ル 比 が, 得 られ るデ ー タに 大
き び治 療 に外 用 され て い る。 本 実 験 に お い て 抗 BPA抗 体 とDESが 交 叉 反 応 を 示 し, DESは
き な影 響 を及 ぼ し, 添 加 す るハ プ テ ンの 結 合 モ ル 比 が大 き くな る につ れ て 阻 害 活 性 が 強 くな る こ と
BPAに
を報 告 し て い る。 本 実 験 で はBSAに
対 し 交 叉 抗 原 で あ る こ とが示 され た 。 し
(152)
対す る結 合
口 病 誌1992,
モ ル比 はDES,
BPB,
DNP,
BPA,
きか っ た。 一 方, 抗BPAモ BPA-BSAの
IPPの
順 に強 く, DNPで
453
順 に大 V.結
ノ ク ロー ナ ル抗 体 と
結 合 に 対 す る 阻 害 はBPA,
IPP, BPBの
59/2
DES,
Bis-GMAや
論
エ ポ キ シ レ ジ ン に 対 し て ア レル ギ
ー性 接 触 皮慮 炎症 状 を 呈 す る 患 者 が い る
は ほ とん ど阻 害
。 これ
され なか った。 結 合 モ ル 比 を 考 慮 し た 場 合 に, BPAの 次 に 大 きな 阻 害 反応 を呈 した の はIPPで
ら の 化 合 物 の 主 要 構 成 成 分 で あ るbisphenolA
あ り, IPPは
造 を 検 索 す る 目 的 で マ ゥ ス にBPAま
フ ェニ ル基 がHに 置 換 して い る点 を
除 き, 化 学 構 造 はBPA同 やDESに
BPA)
一 で あ る。 また, BPB
ovalbumin結
も水酸 基 を もつ 二 つ の フ ェニ ル基 が あ
る。 これ らの こ と か ら, BPAの
の 感 作 性, 交 叉 反 応 性 お よ ( び抗 原 決 定 構
リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 お よ び モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 と,
抗 原決 定 基 は炭
BPAと
類 似 構 造 を 有 す るbisphenol
素 原 子 を 中 心 とし, 水 酸 基 を もつ 二 つ の フェ ニル
p-isopropylphenol (IPP) ,
基 と メチ ル基 の 立 体 的 な 分 子構 造 体 と 考 え ら れ
ES)
た。 この よ うな こ とか ら, bisphenol
Aの 抗 原 性 に
関 して は, そ の 感 作 能 の 存 在 は従 来指 摘 され て き た が, bisphenolAの
た はBPA-
合 体 を 投 与 し, 得 ら れ た 抗BPAポ
お よ び2,
B (BPB) ,
diethylstilbestrol (D
4-dinitrofluorobenzene (DNFB)
のBSA結
合 体 で あ るBPB-BSA,
DES-BSA,
DNP-BSAと
IPP-BSA,
の 反 応 性 を 酵 素 免疫 測
定 法 に よ り検 討 し, 以 下 の 結 論 を 得 た 。
抗 原決 定 基 お よび交 叉 反 応
1)
BPA単
体 をCFAと
性 に つ い て の 詳 細 な 触 析 は本 研 究 が 最初 であ る。
投 与 し て も抗BPA抗
本研 究 か ら明 らか とな った こ とは, bisphenol
が, BPAつvalbumin結
A
は ハ プ テ ンで あ り, タ ンパ ク と結 合 した場 合 に は
と も にr7ウ ス に5回
体 産生 を 誘導 しえ な か った 合 体 は 抗BPA抗
体 産生
を 誘 導 した 。
感 作 性 が 高 くな り, そ の抗 原 決 定構 造 は 炭素 原 子
2)
を 中心 と した, 水 酸 基 を 有す る二 つ の フ ェニル 基
IPP-BSA,
と メチ ル基 の 立 体 的 な分 子 構 造 全 体 で, BPAと
を 示 した 。 3)
共 通 の 化学 構 造, あ る い は類 似 の 立体 構 造 を 有す
抗BPAポ
リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 はBPB-BSA,
DES-BSA,
IgGサ
DNP-BSAと
交叉反応性
ブ ク ラスお よび 抗 原 特 異性 の異 な る
る化 合物 とは 交叉 性 が あ る とい う こ とで あ る。 し
五 つ の 抗BPAモ
たが って 職 場 や 日常 的 な 生 活環 境 の 中で 数 多 く存
い ず れ の モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 に お い て も 固 相 化 抗
在す る と考 え られ るbisphenolAに
原BPA-BSAと
関 連 す る感
ノ ク ロー ナ ル 抗 体 が 得 られ た 。
抗BPAモ
ノ ク ロー ナ ル 抗 体 の
作 源 お よ び 交叉 抗 原 を 同定 し てい く こ とが 重 要 で
結 合 に 対 す る 阻 害 は, BPA-BSAが
最 も 強 く,
あ る。
IPP-BSA,
DES-BSA,
は 中等 度 で
あ っ た が,
DNP-BSAで
Peltonenら30)
はbisphenolAに
紫 外 線 (UV-
BPB-BSAで
は ほ とん ど阻 害 を受 け
B) を 照射 す る と, フ リー ラ ジ カル が 生 成 す る こ
な か っ た こ とか ら, BPAの
とを 報 告 して い る。Allenら31) は, 戸 外 で 働 く配
基 を 置換 基 に もっ フ ェニ ル基 が 関 与 して い る こ と
管 工 事 者 のBPAに
が 示 唆 され た 。
対 す る光 過 敏 症 を 報 告 した。
また, Maguire32) は マ ウス の耳 翼 腫 脹 反 応 を モ デ ル と し て, BPA光
以 上 の 結 果 か ら, BPAは
過敏 症 を 再 現 す る こ とに 成功
抗原決定基 には水酸
タ ソパ ク と結 合した
場 合 に は 感 作 性 を 獲 得 し, そ の 抗 原 決 定 構 造 は 炭
活性化 さ
素 原 子 を 中 心 と し, 水 酸 基 を 置 換 基 に も っ 二 つ の
れ 生 体 タ ンパ ク と結 合 し, 抗 原 性 を 得 て ア レル ギ ー症 状 を発 現 させ た もの と考 え られ る。 今 後, 光
フ ェニ ル基 とメチ ル 基 の 立体 的 な分 子 構 造 全 体 で あ り, BPAと
過 敏 症 も含 め, キ ャ リア ー とな る 生 体 タ ン パ ク の
立 体構 造 を 有 す る化 合 物 とは 交叉 性 を 示 す もの と
同定 や そ の結 合 の メ カ ニ ズ ム の解 明が 必 要 と考 え
考 え られ た。
した 。 これ らは, 紫 外線 に よ りBPAが
られ る 。
(153)
共 通 の 化 学 構 造,
あ るい は 類 似 の
454
口病 誌
平 成4年6月
謝
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辞
稿 を終 え る に あた り, ご懇 篤 な るご 指導 な らび に ご 校 閲 を 賜 りま した佐 藤 温 重 教 授 に 深 甚 な る感 謝 の意 を 表 し ます 。 また, 本 研 究 を 遂 行 す る に 際 し て, 多 大 な る ご助 言, ご教 示 を い た だ き ま した 本 学 医 用 器 材 研 究所 有 機 材 料 部 門, 中 林 宣 男 教授, な らび に, 本 学 医 学部 第1 病 理 学 教 室, 江 石 義信 講 師 に心 か ら感 謝 致 します 。 さ らに, 本 研 究 に対 し絶 えず ご支 援, ご協 力 を い た だ き ま した 本 学 歯 学 部 第2歯 科 理 工 学 教 室, 医 学部 第 1病 理 学 教室, 医用 器材 研 究 所 有 機 材 料 部 門 の皆 様 方 に厚 くお 礼 申 しあ げ ます 。 本 研 究 の 一 部 は, 平 成1, 補 助 金 (一 般A)
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No.01440078の
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モ ノ クロ ー ソ抗 体 に よ る
ピ トー プ の 解 析.
64-73,
of penicilloylated
J. Immunological 1985.
26) Kitagawa, T., Tanimori, H., Yoshida, K., Asada, H., Miura, T. and Fujiwara, K.: Studies on viomycin. XV. Comparative study on the specificities of two anti-viomycin antisera by enzyme immunoassay. Chem. Pharm. Bull. 30: 2487-2491, 1982. 27) Fregert, S. and Rorsman, H. : Hypersensitivity to diethylstilbestrol. Acta Derm Venereol (Stockh) 40: 206-219, 1960. 河 西 信 彦,
455
29) Lee, D., Dewdney, J. M. and Edward, R. G.: The influence of hapten density on the
ウ ス接 触 過 敏 症 にお け る免 疫 応 答 遺 伝子 に つ い て. 日皮会 誌90: 1337-1341, 1980.
28)
59/2
酵
Derm
1987.
(155)
Venereol (Stockh)
68: 408-412,
1988.
原
Bisphenol
Aの
59/2
439
著
感 作 性,
交 叉 反 応 性 お よ び
抗 原 決 定 構 造 に 関 す る研 究
折 原 二 郎 東京医科歯科大学歯学部歯科理工学第2講座 (指導: 佐藤温重教授) 1992年3月9日 受付) Sensitizing Antigenic
Capacity, Determinants
Jirou Department
of Biomaterials
Cross-reactivity of Bisphenol
and A
Orihara
Science, Faculty of Dentistry, Director:
(
Prof. Atsushige
Tokyo Medical and Dental University Sato)
(
Bis-GMA and epoxy resins are known to cause allergic reactions in some patients. The purpose of this research was to investigate the sensitizing capacity, cross-reactivity and antigenic determinants of bisphenol A (BPA) , a major constituent of Bis-GMA and BPA type epoxy resins. Anti-BPA antibodies were prepared from mice injected with BPA-ovalbumin conjugates (BPA-OVA) , and the reactions of the structurally BPA-related compounds were compared with that of BPA using these antibodies by the enzyme immunoassay (ETA) and EIA inhibition test. The findings are as follows: 1) Injection of BPA failed to generate anti-BPA antibodies. However, injection of BPA-OVA was effective in producing antibodies strongly reacting with BPA. 2) Polyclonal anti-BPA antibodies cross-reacted with bisphenol B (BPB) , p-isopropylphenol (IPP) , diethylstilbestrol (DES) and 2, 4-dinitrophenyl (DNP) . 3) Five kinds of monoclonal anti-BPA antibodies were obtained. These monoclonal antibodies reacted specifically with BPA and moderately cross-reacted with IPP, DES and BPB, but not with DNP. The results suggest that BPA-OVA is capable of eliciting anti-BPA antibody production in mice and that the antigenic determinant of BPA is the structure of one central carbon atom, covalently bound with two phenyl groups and two methyl groups.
1.緒
性 試 験, 慢 性 毒 性 試 驗, 感 作 性試 験, 局 所刺 激 試 言
験, 埋 植 試 験 な どが実 施 され, 可能 なか ぎ り副作 用 の 少 ない 材 料 が選 別 され て い る。
近 年, 歯科 材料 の生 物 学 的 安 全 性 が 重 要 視 され
最 近, 歯 科 材 料 に よ る副 作用 の 中で ア レル ギ ー
る よ うに な り, 有用 性 が認 め られ た 新 しい 歯 科 材 料 を 生 体 に適 用 す る場 合 に は十 分 な安 全 性 が 求 め
が 注 目され, 歯科 治療 を 受 け る患 老 の み な らず,
られ て い る。 そ の 前 臨 床 的 毒 性 試 験 と して 急性 毒
歯 科 医 師, 歯 科 技 工士 を は じめ とす る歯 科 医療 従
(139)
440
口病 誌
平 成4年6月
事 老 の 側 で も 重 大 な 関 心 事 の 一つ に 挙 げ ら れ て い
と再 接 触 す る と炎 症 性 リ ン ホ カ イ ン を 産 生 し, 局
る1∼3)。 金 属 材 料 に 起 因 す る ア レ ル ギ ー に つ い て
所 に 好 中 球,
は 古 くか ら報 告 が あ り, 1928年
生 ず る 反 応 で あ る。1∼
にFleishmannら
マ ク ロ フ ァ ー ジ の 集 積 を 伴 う炎 症 を 皿 型 は液 性 免 疫 で 即 時 型
は ア マ ル ガ ム に よ る 口 内 炎, 皮膚 炎 が 水 銀 ア レ ル
過 敏 症 で あ り, IV型 は 細 胞 性 免 疫 で あ り遅 延 型 過
ギ ー で あ る こ と を 報 告 し た 。 そ の 後,
コ
敏 症 で あ る。 歯 科材 料 に よる ア レルギ ー は主 とし
バ ル ト, ニ ッ ケ ル, パ ラ ジ ウ ム に つ い て も ア レ ル
てIV型 で あ り, 接 触 過 敏 症 が 多 い 。 一 部 の 歯 科 材
ギ ー 惹 起 性 が 明 ら か と な っ た 。1940年
料,
ク ロ ム,
代にアク リ
ル レジ ンが 歯科 医療 に導 入 され るに お よ び義 歯 床 用 レ ジ ン に よ る ア レ ル ギ ー 患 者 が 漸 増 し, ー, 重 合 開 始 剤, 安 定 剤,
モ ノマ
従 来,
色 素 な どが ア レルギ ー
NuvaFil (R) bisphenol
が,
がAdaptic (R) と
が(
作 性 を 調 べ る も の で あ る。 ハ プ テ ン と考 え ら れ る 低 分 子 物 質 の 抗 原 性 を 明 ら か に す る た め に は, 低
に対 す るア レル ギ ーを 報 告 した
当 該 患 者 は パ ッチ テ ス ト でConciseの
GPM-test)
行 わ れ て き た6∼8)。 こ の 試 験 は 被 驗 物 質 の 皮 膚 感
感 作 物 質 と 考 え た 。Niinimaki
ら5) はConcise (R)
1型
歯 科 材 料 や 医用 材 料 の感 作 性 試 驗 に はモ
guineapigmaximizationtest,
に 対 す る ア レ ル ギ ー 患 者 を 報 告 し, Aを
ア レ ル ギ ー が あ る が,
ル モ ッ ト を 用 い た マ キ シ ミ ゼ イ シ ョン テ ス ト
の 原 因 と な る こ とが 知 ら れ て い る 。 レ ジ ソ 系 充 填 材 料 に つ い て は, Nathansonら4)
医 用 材 料 で はH型
は まれ で あ る。
分 子物 質 単 体 の 他 に タンパ ク結 合 体 を 感 作 抗 原 と
成分
し, 感 作 成 立 を 多 く の 指 標 で 検 索 す る 必 要 が あ
に は 存在 し ない エ ポ キ シ レジ ン に も陽 性 反 応 を呈
る 。 し か し, 歯 科 材 料 に つ い て こ の 種 の 研 究 は ほ
し た こ とか ら 判 断 し, Concise中
とん どない 。
bisphenolAの
誘 導 体,
に 含 まれ て い る
す な わ ちBis-GMAと
歯 科 用 レジ ン に は種 々 の ポ リマ ーが 利 用 され て
の 交 叉 反 応 に よ る ア レ ル ギ ー と判 明 し た 。 歯 科材 料 の 中 で ア レル ギ ー の原 因 と な る もの は
い る.bisphenolAは
コン ポ ジ ッ ト充 填 材 の 成
分 と な るBis-GMAや
多 様 な 用 途 の あ る エ ポキ
シ 化 合 物 等 の 合 成 の 出 発 物 質 で あ る 。Bjorker
多 くが ハ プ テ ソ で あ り, 生 体 成 分 と結 合 し て 完 全 抗 原 と な る 。 一 般 に, 抗 原 に 対 す る 感 作 成 立 の 過
ら9, 1o)は, AdapticやConciseの
程 は 液 性 免 疫 と細 胞 性 免 疫 と が あ り, 液 性 免 疫 で
thylene
はIgM, れ,
IgG,
血 中,
IgE抗
あ る い は 細 胞 障 害 性T細
生 さ れ る 。CoombsとGe11は ら ア レ ル ギ ー を1∼IV型 た 。 す な わ ち,
胞 (Tc)
ま で は 陽 性,
の 四 つ の タ イ プに 分 類 し
は 陰 性,
り, II型 はIgMあ
方,
体 の 関与 す る反 応 で あ
る い はIgG抗
体 が 産 生 され,
K細 胞 が 関 与 す る 抗 体 依 存 性 細 胞 媒 介 性 細
1, 850で
は 陰 性,
epichlorohydrinは
感作 能
イプのエポキシ は, 分 子 量1, 280 ま たbisphenolA 陽 性 で あ っ た11) 。 一
エ ポ キ シ レ ジ ン は 用 途 が 広 く, 繊 維 ガ ラ ス, 織 物 に 付 い て い る ラ ベ ル,
ン ダ ル,
カ ニ ュー レな どにエ ポ キ シ レ ジ ンあ るい
胞 障 害 作 用 に よ り組 織 の 細 胞 が 障 害 さ れ る 反 応 で あ る 。 皿 型 はIgMあ
告 が あ る12∼17) 。 と こ ろ が,
体 が 組織 中
行 い,
Bis-GMAは
接 着 剤,
はbisphenolAに
る い はIgG抗
お
あ っ た と し て も 低 い と 報 告 し て い る。
レ ジ ン に つ い て のGPM-testで
作用 機 序 の 相 違 か
IgE抗
っ い てGPM-testを
bispheno1Adiglycidyletherタ
が 産(
成 分 のtrie-
dimethacrylate (TEGDMA)
陽 性 率 は7%,
が な い か,
胞
1型 は ア ト ピ ー ま た は ア ナ フ ィ ラ
キ シ ー 型 と よ ば れ,
補 体,
TEGDMAの
組 織 液 中 に分 布 す る。 細
胞 性 免 疫 で は 遅 延 型 過 敏 反 応 に 関 与 す るT細 TDTH) ,
よ びBis-GMAに
体が免 疫 系 臓 器 で塵 生 さ
リ ン パ 液 中,
glycol
ワ ッ ク ス,
サ
よ るア レル ギ ー性 皮膚 炎 の報 エ ポ キ シ レジ ン は ア
これ に よ り活性 化 され
レル ギ ー性 皮 膚 炎 の 原 因 物 質 と して の 頻 度 が 高い
た 補 体 な ど に よ り組 織 が 障 害 を 受 け る 反 応 で あ
に も か か わ ら ず, 感 作 源 そ の も の は 不 明 で あ る 場
る 。IV型 は マ ク ロ フ ァ ー ジ を は じ め と す る 抗 原 提
合 が 多 い18》。
の 抗 原 と複 合 体 を 形 成 し,
示 細 胞 に よ り抗 原 を 認 識 し た 感 作TDTHが
臨 床 的 に はア レル ギ ー疾 患 の 原 因 除去 療 法 に 際
抗原
(140)
口 病 誌1992,
図1
bisphenol
A,
epoxy
resin,
して, パ ッチ テ ス ト等 で 感 作 物 質 を 同 定 し て い
Bis-GMAモ
59/2
441
ノマ ー の構 造 式
一タ ン パ ク結 合 体 に 対 す る 抗bisphenolAポ
リ
る。 しか し, パ ッチ テ ス トは 偽陽 性 反応 を 呈 しや
ク ロー ナ ル抗 体 の交 叉 反 応性 にっ い て 比較 検 討 し
す く, ま た, パ ッチ テ ス トで 陽 性 を示 す 物 質 が 実
た 。 さ ら に3)
際 の 感 作 物 質 と交 叉 反 応 を 起 こ して い る場 合 もあ
異 性 を 調 べ る た め に, bisphenolAに
り うるの で, パ ッチ テ ス ト等 の 感 作 試 験 のみ で は
ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 作 製 し, そ の 抗 原 特 異 性 に つ
感 作 物 質 の 同 定 は 難 しい もの と思 わ れ る。 現 在 ま
いて 免 疫 学 的 に検 討 した。
で の と こ ろ, bisphenolAの
bisphenol
Aの
抗 原 決 定基 の 特 対 す るモ
感 作性, 抗 原 決定 II.実
基, 他 の 抗 原 物 質 との 交 叉 反 応 性 に つ いて は十 分 に 明 らか に され て は い な い。
1.抗
そ こで, 本 研 究 はBis-GMAの
み な らず エ ポ キ
験 材 料 お よ び方 法
原
抗 原 に は, 2, 2-bis (4-hydroxyphenyl)
シ レジ ンの 構 成 成 分 で あ るbisphenolA (図1)
ane (bisphenolA,
BPA,
の感 作性, 交叉 反 応 性, さ ら に その 抗 原 決 定 基 と
の タ ン パ ク結 合 体,
な る構 造 を液 性 免 疫 誘 導 能 お よび抗 体 の 特 異性 を
有 す る2, 2-bis (4-hydroxyphenyl)
指 標 とし て 以 下 の 三 つ の実 験 を 設 け て検 討 した。
phenolB, IPP,
BPB,
proP
和 光 純 薬) , お よ び そ
な ら び にBPAと
類 似構 造を butane (bis-
東 京 化 成) , P-isopropylphenol
東 京 化 成) ,
diethylstilbestrol ( (DES,
なお, 歯 科 材 料 に よ る ア レ ル ギ ー はIV型 ア レル ギ ーで あ り, 感 作 リンパ 球 に よ って 媒 介 され る細胞
Aldrich) ,
性 免 疫 応 答 で あ るが, 感 作 成 立段 階 にお け る抗 原
和 光 純 薬) (図2)
提 示 細 胞 の 抗 原 の 取 り込 み,
を 用 い た 。 タ ン パ ク 結 合 体 の 作 製 に は, BPAを
リンパ 球 へ の抗 原 提
2, 4-dinitrofluorobenzene (DNFB, の そ れ ぞ れ の タ ン パ ク結 合 体
示 の 過 程 は液 性 免 疫 と 同一 の 過 程 を 経 る と考 え ら
ヘ ミサ ク シ ネ ー ト化 す る こ とに よ りカ ル ボ キ シ ル
れ る こ と か ら, bispheno1Aの
基 を 導 入 し, さ ら に カ ル ボ ジ イ ミ ド 法 でbovine
感 作 成 立 の判 定
serumalbumin (BSA)
は液 性 免 疫 誘 導 を 指 標 と し た 。1) bisphenolA
OVA)
単 体 を抗 原 と し て マ ウス に 投 与 す る ほ か, bisphenol
の リ ジ ン 残 基 の ε一ア ミ ノ 基( と 結 合 さ せ
た (図3)
A-タ ンパ ク結 合 体 を 作 製 し, これ を 抗 原
あ る い はovalbumin
。BPB,
IPP,
DESもBPAと
とし て用 い て マ ウス に 投与 し, そ の液 性 免 疫 誘 導
ヘ ミサ ク シ ネ ー ト化 し た 後,
能 を 調 べ た 。 ま た, 抗bisphenol
よ りBSAと
A抗
体産生に
同様 に
カ ル ボ ジ イ ミ ド法 に
結 合 さ せ た 。 な お, DNFBは
反応
お け る マ ウス の 系 統 差 に つ い て 検 討 し た 。 つ ぎ
性 に 富 む の で, 直 接dinitropheny1 (DNP)
に, 2) bisphenol
タ ン パ ク に 結 合 さ せ た 。 感 作 抗 原 と し て はBPA
Aの
交 叉 抗 原 として の 性 質 を
明 らか にす るた め に, BPAと
単 体,
共通 の 化 学 構 造,
お よ びBPA-OVA結
基を
合 体 (BPA-OVA)
す な わ ち 水 酸 基 を 置換 基 に もつ 一 つ あ る い は二 つ
を 用 い た 。 得 られ た 抗 体 の特 異 性 の 検 討 に は それ
の フ ェ ニル 基 や メチ ル 基 を 有 す る各種 低 分 子 物 質
ぞ れ のBSAと
(141)
の 結 合 体 で あ るBPA-BSA,
BPB-
442
口病 誌
平 成4年6月
bisphenol
A (BPA)
BPA
hemisuccinate
bisphenol B (BPB)
p-isopropylphenol (IPP)
diethylstilbestrol (DES)
BPA-protein
conjugates
図3BPA-タ
2, 4-dinitrofluorobenzene (DNFB)
図2
BPA関
ソパ ク結 合 体 の 調 製 方法
た 。 生 成 物 はKBr錠
連 化 合物 の構 造 式
剤 に し,
分 光 装 置 (Nicolet
FTIR
フ ー リエ 変 換 赤 外
20 DX)
に て,
収 ス ペ ク トル 分 析 を 行 い, BPAヘ BSA,
IPP-BSA,
OVAと
DES-BSA,
DNP-BSAを
用 い,
トの 確 認 を 行 っ た 。BPAヘ
の 交叉 反 応 を 回 避 した。
BPAの
方 法 に 準 じ た 。 す な わ ち, とsuccinic
anhydride
に, pyridine
合 さ せ た20) 。BSA (Fraction bulin-free,
BPA6.79 (25mM)
7.5g (75mM,
100mlを
の
Sigma)
和 光 純 薬)
anhydrideとpyridineを
mgを
マ ト グ ラ フ ィ ー (TLC)
サ ク シ ネ ー ト25mgを
plate (Silica
Gel
60F
254, Merck)
を 求 め た 。 次 に,
光 純 薬)
5m1に
carbodiimide
に添 加
置 後CMC10mgを
30
N-dimethylfor-
溶 解 し たBPAヘ
ミ ず
調 整 し た 。10分 間 放
加 え, 遮 光 し て 室 温 に て16
時 間 撹 搾 を 続 け 反 応 さ せ た 。Dulbeccoの
リン 酸
展 開 溶 媒 に 用 い た カ ラ ム ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー (SL
緩 衝 液 (PBS,
間透 析
licaGe160,
後, 沈 殿 を 遠 心 分 離 し (1, 500×9,
Merck)
酢 酸 エ チ ルを
Sigma)
連 続 撹 搾 し な が ら1滿
っ 添 加 し た の ち, pH5.5に
し, 酢 酸 エ チ ル で 展 開 し, 紫 外 光 下 に て 出 現 し た ス ポ ッ トのRf値
溶 解 し, 1-cy-
添 加 し た 。 さ ら に, N,
去 し た 。 生 成 物 を 分 離 同 定 す る た め に, 薄 層 ク ロ を 行 った 。 試 料 の一 部 を
glo-
ま た はOVA (gradeV,
metho-p-toluenesulfonate (CMC, 除
結
essentially
超 純 水25m1に
mamide (和
TLC
る い はOVAと V
clohexyl-3- (2-morpholinoethyl)
加 え て 溶 解 し, 85℃ に て
4時 間 反 応 さ せ た 。 次 に 生 成 物 をchloroformで 抽 出 し, succinic
Sigma)
50mgを
ミサ ク シ ネ ー
ミサ ク シ ネ ー トは カ
ル ボ ジ イ ミ ド法 に よ りBSAあ
ヘ ミサ ク シ ネ ー ト化 はWainerら19)
赤外 吸
で 生 成 物 を 分 離 した。 得 ら
れ た フ ラ ク シ ョ ン ご と にTLCを 値 を 示 す フ ラ ク シ ョン を 集 め,
行 い,
pH7.4)
に 対 し4℃
で3日 5min) ,
上清
を 分 注 し て 一30℃ に 凍 結 保 存 し, 実 驗 に 用 い た 。
同 じRf
ま た, BSA (分
溶媒を減圧留去 し
(142)
子 量69, 000)
1mg/ml,
0VA (分
口 病 誌1992,
子 量46, 000) 1mg/mlお
よ びBPA (分
50μg/mlの280nmに
子 量228)
を 測 定 し, BPAに
の2週
つ い て は モ ル 吸 光 係 数 を 求 め,
BPA-BSAlmg/mlあ
IPP,
He,
結合お
10m1に
α2Mホ
和 光 純 薬)
1.4m1に
100μ1をBSA溶
与 群 の2群
4.抗BPA抗
4-dioxane
て 希 釈 し,
マ ウ ス にOVA投
BPAま
この 希 ( 釈 溶 液
を 設 け, 一 群7匹
EIA)
体 をenzyme
PBSに
の 各 ウ ェ ル に50mM炭
360nmに
お け る ε-DNP-リ
を17, 530,
280nmに
な りを25%, し て, BSAの
ジ ンの モ ル吸 光 係 数
お け る ε-DNP-リ
BSAlmg/m1の0.D.28。
O.D.36。, O.D.280の
濃 度 を 算 出 し, BSAに
島 津 製 作 所)
9: 1あ る い は1: 2.実
1)
C3H/He,
4℃
を0.67と
で 一 夜 静 置 し, 固 相 化 し た 。 抗 原 溶 液 を 除 去 後,
よび
0.2%
結
調 製)
Sigma)
Tに
(
お よ び0.5%
を 含 むPBS (PBS-T,
て そ れ ぞ れ160倍
Tween20
pH7.4) ( 抗 体)
に て5 はPBS-
に 希 釈 し て, 50μ1ず
ウ ェ ル に 分 注 し, 室 温 に90分
つ各
静 置 後, PBS-Tで
2次 抗 体 と し てPBS-Tに
て4, 000倍 に 希 釈 し た ビ オ チ ン 化 抗 マ ウ スIgGヤ
を用 い た。 マ ウ ス は よ り購 入 し,
つ 分 注 し,
回 洗 浄 し た 。 マ ウ ス 抗 血 清 (1次
( ethanol
齢 の 雌 性 マ ウ ス (BAL
日 本 生 物 材 料 セ ン タ ー (東 京)
を100μ1ず
gelatin (Sigrna)
5回 洗 浄 し た 。 次 に,
C57BL/6)
pH9.6) とし
験動 物
実 験 動 物 に は6∼10週 B/c,
酸 緩 衝 液 (CBB,
Flow)
て10μ9/m1に
対 す るDNPの
を用 い た。
Assay-Plate,
に て 希 釈 し た 抗 原 溶 液BPA-BSA (BSA量
分 光 光 度 計 はUV-240
を 使 用 し, 溶 媒 はPBS:
ェ ル (マ イ ク ロ プ レ
ジ ソの 重
値 よ りDNPお
合 モ ル 比 を 求 め た 。 な お,
の
immunoassay
に よ り 測 定 し た 。96ウ
ー ト (Titertek (R) Immuno
間 透 析 し た 。PBS中
5回
免疫 し た マ ウ ス血
時 間 擬 搾 を 続 け な が ら 反 応 させ た 。 反 応 終 了 後, で3日
と し,
体 の測 定 法 た はBPA-OVAを
清 中 の 抗BPA抗
液 に 添 加 し, 遮 光 し て 室 温 で3
対 し4℃
C3H/
与 群, BPA-
免 疫 し, 同 様 に 抗 血 清 を 得 た 。
ウ 酸 緩 衝 液 (pH9.0)
溶 解 し た 。DNFB10μ1を1,
C57BL/6系
OVA投
よ び 結 合 モ ル 比 の 測 定 は 以 下 の よ うに 行 っ た 幻)。 BSA200mgを
の マ ウ スか ら全採 血 した 。血
間 放 置 後 血 餅 を 分 離 し, 抗 血 清 を
系 統 差 の 有 無 を 調 べ る た め, BALB/c,
対 す る結 合 モ
ル 比 も 同 様 に 求 め た 。DNFBとBSAの
行 った。 各回 の 免疫
に 凍結 保 存 して 以下 の実 験 に 供 した。
モ ル数 を 求
DESのBSAに
後 に 各 群5匹
443
得 た 。 抗 血 清 は サ ソ プ ル チ ュ ー ブ に 分 注 し-80℃
差 か らBSA
1モ ル あ た りに 結 合 し て い るBPAの
間 隔 で1∼4回
液 は 室 温 に1時
る い はBPA-OVAlmg/
mlとBSAlmg/mlのO.D.280の
め た 。BPB,
加 免 疫 は2週
お け る 吸 光 度 (O.D.280)
59/2
ギ 血 清 (American
1週
Qualex)
を 各 ウ ェ ル に100μ1
ず つ 入 れ, 室 温 で30分 反 応 さ せ た 。 さ ら に,
間 の 馴 化 期 間 を 設 け た 。 実 験 期 間 中 は, 室 温23± 2℃,
し た ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 標 識 ス ト レ プ トア ビ ジ ン
明 暗12時 間 周 期 の 環 境 下 で 飼 育 し, 固 形 飼
料CE-2 (日 3.免
本 ク レ ア)
マ ウ ス は 一 群25匹
与 群 お よ びBPA-OVA投 ethanol (9:
1)
お よ び1.4×10-2%H202を
に 溶 解 し濃 度1mg/ml
緩 衝 液 (pH5.4)
い はBPA-OVAを adjuvant (CFA,
等 量 のcomplete Difco)
マ ル ジ ョ ン を 作 製 し, μ1ず つ 足 蹠
25μ1を
る
洗 浄 し, 0.3%
含 む0.1Mク
Freund's
添 加 し,
反 応 を 停 止 さ せ,
(143)
マ イ ク ロプ にて
マ ウ ス の 系 統 差 を 調 べ る 実 験 に お い て は,
前述
測 定 した 。
と同 樣 にBPA-OVAをCFAと
腹 部 ・ 背 部 の 皮 下 に 注 射 した 。 追
つ入れ
後, 2NHC1
コ ロ ナ 電 気)
O.D.492-610を
に つ き 総 量50
エ ン酸
を 各 ウ ェ ル に100μ1ず
レ ー ト光 度 計 (MTP-22形,
と 混 和 し て, 均 一 な エ
マ ウ ス1匹
つ 入 れ, 室 温 に (
て5回
遮 光 し て 室 温 で 反 応 さ せ た 。15分
と し て1mg/m1 て 希 釈 し た 。BPAあ
に希 釈
o-phenylenediamine-dihydrochloride (Sigma)
と し, BPA投
与 群 を 設 け た 。BPA
と し た 。BPA-OVAはOVA量 に な る よ う にPBSに
て4, 000倍
を 各 ウ ェル に100μ1ず
30分 静 置 し た 。PBS-Tに
疫方 法
BALB/c系
はPBS:
Dako)
と 水 は 自 由 摂 取 させ た 。
洗 浄 後, PBS-Tに
PBS
-Tで5回
と もに2週
間隔
444
で5回
口病 誌
平 成4年6月
皮 下 投 与 し,
取 し たBALB/c,
5回 目 の 投 与 か ら2週
C3HIHe,
の 抗 血 清 をPBS-Tに 原BPA-BSAと
C57BL/6系
て160倍
希 釈 し,
反 応 さ せ, EIAに
後 に採
bovine
マ ウス
てO.D.492-610
第1病
IPP-BSA,
リク ロー ナ
91yco14000 (PEG,
各 抗 原 溶 液 をBSA量
とし
て 希 釈 し, 96
ウ ェ ル マ イ ク ロ プ レ ー トの 各 ウ ェ ル に100μ1ず 分 注 し て 固 相 化 し た 。BPA-OVAを5回 マ ウ ス 抗BPAポ
体 (抗 血 清)
10min)
をPBS-Tに
後, RPMIに し, RPMI/FBSを
て1回
遠 心 洗 浄 (250×9, 加 え 脾 細 胞 が5×106/
な る よ う に 調 製 し, 96ウ ェ ル マ イ ク ロ プ レ の 各 ウ ェ ル に100μ1ず
薬) , 4x10-7Maminopterin (Fluka)
希 釈 した もの
BPB-BSA,
DNP-BSAと
FBS (HAT培
を 測 定 し, そ
し た 。4日
目お よ び7日
にHAT培
地 よ りaminopterinを
DES-BSA, て0.D.492-61・
の 結 果 得 ら れ た 結 合 率bound/tota1 (B/T) 較 す る こ と に よ り, BPA関
を比
リク ロ ー ナ ル 抗 体 の 交 叉 反 応 性 を 検 討 し
た.Tは
抗 血 清 原 液 と 固 相 化 抗 原 と の 結 合 をEIA
に よ り求 め た 吸 光 度 と し,
よ り求 め た
BPA-OVA結
合 体 をCFAと
動 静 脈 よ り約50μ1の
目よ り
ハ イ ブ リ ドー マ を 維 持 し た 。
BSA,
用 い,
BPA-BSAを
1次 抗 体 に は コ ロ ニ ー
高 い 抗 体 価 を 有 す る 抗BPA抗
と
と も に2週
間隔で
目 の 免 疫 か ら2週
後 に尾
7。 抗BPAモ L鎖,
腹 腔 内投 与 し
Eagleのrninimum 日水 製 薬)
essential に て3回
medium
ブ ク ラ ス (IgG1,
お よ びL鎖 (IgLκ, Mouse
PharMingen)
スパ ーテ ル に て 脾 細胞 を 分 散 さ
MEM,
のIgGサ
clonal
後に 常法 に従 って無 菌 的 に
せ て,
ノ ク ロー ナ ル 抗 体 のlgGサ
ブ ク ラ ス,
力 価 お よび特 異 性
モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 (ハ イ ブ リ ド ー マ 培 養 上
よ り測 定
IgG3)
た 。 最 終 免 疫 の2日
の ク ロー
ニ ン グを 行 い モ ノ ク ロー ン と した 。
血 液 を採 取 した 。 血 清 を 分
対 す る 抗 体 価 をEIAに
体 を 産 生 して い る
ハ イ ブ リ ド ー マ に 限 界 希 釈 法 に よ る3回
て希釈した
清)
Immunoglobulin
IgG2a, IgLλ)
IgG2b, をMono-
Isotyping
を 用 い て 決定 し た。
Kit (
各 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 と 固 相 化 抗 原BPA-BSA と の 結 合 率B/T (%)
遠 心 洗 浄 (250×9, (
し, 脾 細 胞 浮 遊 液 を 調 製 した 。 あ ら か じ
めRPMI1640 (RPMI,
除 い たRPMI/
交 換 し た 。14日
よ り行 っ た 。 固 相 化 抗 原 に は
し, 高 い 抗 体 価 を 示 し た マ ウ ス に 最 終 免 疫 と し て
10min)
10日 目
定 と 同 様 にEIAに
BPA-OVA (1mg/mの0.2m1を
脾 臓 を 摘 出 し,
100μ1を
つ添加
地,
に 対 す る抗 体 を 産 生 し て い る ク ロ ー ン は 除 い た 。
マ ウ ス にOVA量
な る よ うにPBSに
5回 皮 下 注 射 し た 。5回
離 後, BPAに
目にHAT培
が 観 察 され た ウ ェ ル の 培 養 上 清 を 使 用 し た 。BSA ノク ロ ー ナ ル抗 体 の 作 製法
6週 齢 の 雌 性BALB/c系 し て1mg/m1に
が 入 っ たRPMI/
ハ イ ブ リ ド ー マ の ス ク リー ニ ン グ は 抗 体 価 の 測
吸光 度 とした 。 6.抗BPAモ
地)
RPMI/FBSで
Bは 各 希 釈 率 に お け る
抗 血 清 と固 相 化 抗 原 の 結 合 をEIAに
光純 お よ び1.6
地 う を 各 ウ ェ ル に100μ1ず
FBS (HT培
連 化 合 物 に 対 す る抗
BPAポ
つ 播種 し
た 。24時 間 後, 1×10-4Mhypoxanthine (和
リク ロー ナル 抗
て160倍
た 。1分 10min)
ー ト (Coster)
免疫 し
0.5m1にRPMI0.5
×10-5Mthymidine (Sigma)
反 応 させ た 。EIAに
な
上清
を 細 胞 ペ レ ッ トに 加 え, 細 胞 融 合22) を 行 っ
m1に
つ
Merck)
を 原 液 と し, 倍 々 希 釈 し, 固 相 化 抗 原BPA-BSA, IPP-BSA,
10に 後,
添 加 し, 37℃ に 保 温 し て お い た 溶 液 (50%
PEG)
DES-BSA
な る よ う にCBBに
たBALB/c系
と脾 細 胞 が1:
る よ う に 混 合 し 遠 心 (250×9,
m1を
BPB-BSA,
て10μ9/m1に
理 学 教 室 よ り供 与)
定 によ り
ル抗 体 の交 叉 反 応 性
お よ びDNP-BSAの
本学 医学 部
を 除 去 し た 。 加 温 し て 溶 解 し たpolyethylene
連 化 合 物 に対 す る抗BPAポ
BPA-BSA,
培 地 (RPMI/FBS)
腫 細 胞P3/X63-Ag8.U1 (P3U1,
有 意 差 の 検 定 を行 った 。 5.BPA関
Flow)
に て対 数増 殖 期 に な る よ うに培 養 した マ ウ ス骨 髄
固相 化 抗
を 測 定 し た 。 デ ー タ はStudentのt検
serum (FBS,
原 溶 液BPA-BSAを
日 水 製 薬) 十10%Feta1
培 養 上 清 の2倍
(144)
を 求 め た 。 す な わ ち, 抗 固 相 化 し, ハ イ ブ リ ド ー マ
希 釈 系 列 を 作 製 し て,
モ ノク ロー
口病 誌1992,
ナ ル 抗 体 とBPA-BSAを お い てEIAに B/Tが
反 応 さ せ,
445
各 希釈 率 に
てO.D.492-610。 を 測 定 し た.ま
約50%を
59/2
た,
示 す と きの 抗 体 希 釈 率 の逆 数 を
抗 体 価 と して 求 め た 。 さ ら に,
B/Tが80%に
な る よ う にPBS-Tに
て 希 釈 し た ハ イ ブ リ ド ー マ 培 養 上 清 を 用 い て, BPA-BSA,
BPB-BSA,
IPP-BSA,
DES-BSA,
DNP-BSAを200ng/ml∼200μ9/mlの 囲 で 希 釈 し,
濃 度範
この モ ノク ロー ナ ル抗 体 と遊 離 抗原
の 共 存 す る 溶 液 を,
BPA-BSAを
固 相 化 した マ ル
チ ウ ェ ル プレ ー トの 各 ウ ェ ル に50μ1ず
っ分注 し
図4BPAヘ
ミサ ク シ ネー トの 赤 外 吸 収 スペ ク トル分 折
て, 遊 離 抗 原 と 固 相 化 抗 原 を 競 合 させ た 。 各 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 に つ い て,
固 相 化 抗 原BPA-BSA
と モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 結 合 をEIAに 度 と し て 測 定 し た 。 抗BPAモ とBPA-BSAの
よ り吸 光
表1BPA関 BSA1モ
ノ ク ロー ナ ル抗 体
結 合 反 応 がBPA関
連 化 合 物一BSA結 合 体 にお け る ル に対 す る結 合 モ ル比
連 化 合 物-
タ ンパ ク結 合 体 に よ って受 け る阻 害 の程 度 を 比 較 す る こ と に よ り, 各 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 抗 原 特 異 性 を 検 討 した 。 皿.結
ル の 吸 収 が 認、 め ら れ,
果
確 認 し た (図4) 1.マ 1)
ウ ス に お け る抗BPA抗 BPAお
体 の 産生
よ びBPA関
Rf値
連 化 合 物 の タ ンパ ク
OVA)
せ,
BPB,
IPP,
DESは
直 接 タ ン パ ク (BSA,
と結 合 させ る こ とが で き な い た め,
ミサ ク シ ネ ー トを
。
が0.60の
精 製 物 (BPAヘ
ミサ ク シ ネ ー
ト) を カ ル ボ ジ イ ミ ド法 に よ りタ ン パ ク と結 合 さ
結合体 BPA,
BPAヘ
BSAお
BPA-OVA)
これ ら
よ びOVAと
の 結 合 体 (BPA-BSA,
が 得 ら れ た 。BSAお
ル に 対 す るBPAの
よ びOVA1モ
結 合 モ ル 比 は そ れ ぞ れ2.7,
の 化 合 物 を ヘ ミサ ク シ ネ ー ト化 し て カ ル ボ キ シ ル
α9で
あ っ た 。 同 樣 に, ヘ ミサ ク シ ネ ー ト化 し た
基 を 導 入 し,
BPB,
IPP,
さ ら に カ ル ボ ジ イ ミ ド法 に よ り タ ン
パ ク と結 合 させ た。 BPAの
媒 中 でsuccinic
反 応 さ せ,
Rf=0, が0.60,
接BSAと
EIAに
が0.60
の 部 分 か ら は 白 色 の 粘 性 を も つ 半 固 形 物3.29が 得 られ,
Rf値
得 ら れ た 。Rf値
が0.30か が0.60,
赤 外 吸 収 ス ペ ク トル 分 析 か ら,
あ っ た 。DNPは
そ の 結 合 モ ル 比 は3.7で
お よび フ ェ ニ
お い て 固 相 化 抗 原 また は 遊 離 抗 原 と し
DES-BSA,
合 体 が 作 製 され た 。
DNP-BSA結
マ ウ ス に お け る 抗BPA抗 マ ウ ス にBPA単
合 体 をCFAと
回 皮 下 注 射 し,
(145)
あ
お よび
BPB-BSA,
OVA結
直
。
BALB/c系
精製物の
カ ル ボキ シ ル基 と
エ ス テ ル 結 合 の カ ル ボ ニ ル の 吸 収,
16.6で
その 結 合 モ ル比
て 使 用 す るBPA-BSA,
2)
ら は 白 色 の 固 形 物1.79が お よ び0.30の
結 合 体BPB-BSA, 得 ら れ,
感 作 抗 原 と し て 使 用 す るBPA-OVA,
に 対 し, Rf値 (
ス ポ ッ トが 現 れ た 。Rf値
2.3,
結 合 させ,
っ た (表1)
て 分 離 し た と こ ろ, BPA
92) , pyridine (Rf=68) 0.30の
anhydride
そ の生 成物 を酢 酸 エチ ルを 展
開 溶 媒 に 用 い たTLCに
DESとBSAの DES-BSAが
は そ れ ぞ れ5.9,
ヘ ミサ ク シ ネ ー ト化 に お い て は, BPA
6.79をpyridine溶 乞59と
IPP-BSA,
IPP-BSA,
体の産生 体 ま た はBPA-
と も に2週
各 投 与 か ら2週
間 隔 で1∼5
間 後 に採 取 した血
446
口病 誌
平 成4年6月
図6抗BPA抗 図52週
間隔 で1∼5回
系 マ ウ スの 抗BPA抗
体 産 生 に お け る マ ウ ス の系 統 差
抗 体価 は抗BPA抗 体 をEIAに 吸光 度 (0。D、492-610) を 表す
免 疫 を 行 ったBALB/c 体 産 生 の変 化
C57BL/6,
C3H/He系
ら れ な か っ た が,
マ ウ ス間 に 有 意 差 は 認 め
BALB/c系
マ ウ ス もBPAに
清 中 のIgG抗BPA抗 体 の 抗 体 価 の 経 時 的 変化 は図5に 示 す ご と くで あ る。BPA単 体 投与 群 で
対 し 高 応 答 性 を 示 し た (図6)
はCFAと
ともに5回 注 射 して も全 経 過 に お いて
BALB/cお
抗BPA抗
体 の 産 生 は認 め られ なか った 。 これ に
体 が 誘 導 され,
対 しBPA-OVA結
合 体 をCFAと
BPA-OVA結
と もに マ ゥ ス
は, 抗OVA抗
マ ウ ス の 抗BPA抗
体産生
リ ク ロー ナ ル 抗 体 のBPA関
BPA-OVA結 で5回
交 叉 反 応 し な い た め, 固相 化 抗 原 に 用 い たEIAで
ま た,
マ ウ ス に 抗BPA抗
連化合
物 に対 す る交 叉 反 応 性
免 疫 で は 高 い抗 体 価 を 維 持 して い た。 なお, OVA とBSAは
よ びC3H/He系
2.抗BPAポ
体 価 の 上 昇 が認 め られ, そ れ 以後 の 追 加
BPA-BSAを
。
合 体 投 与 に よ りC57BL/6,
に は系 統 差 が 存 在 し てい た 。
に投 与 した 群 で は, 2回 の 投 与 以 降 か ら抗BPAOVA抗
て測 定 した と きの
体
合 体 をCFAと
と も に2週
皮 下 投 与 し たBALB/c系
れ た 抗 血 清 を 抗BPAポ
間隔
マ ウスか ら得 ら
リク ロー ナ ル抗 体 として
の反 応 は回 避 され て い る の で, 抗BPA-OVA抗
使 用 し た 。BPA関
体 を 以 後 は抗BPA抗
叉 反 応 性 を 調 べ る た め に, BPA-BSA,
BPB-BSA,
IPP-BSA,
マイ クロプ
BPA-OVA結
体 と して扱 った 。
合体 投 与 に よ るマ ウス の抗BPA
DES-BSA,
連 化 合 物-BSA結
DNP-BSAを
合 体 との交
抗 体 産 生 に お け る 系統 差 を 明 らか にす るた め に,
レ ー トに 固 相 化 し,
主 要 組 織 適 合 遺伝 子複 合体 の ハ プ ロタイ プの 異 な
リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 各 希 釈 系 列 と の 結 合 率B/T
るマ ウス の3系 統 にBPA-OVA結
合 体 をCFA
%)
をEIAに
こ の 固 相 化 抗 原 と抗BPAポ
よ り測 定 し た と こ ろ, BPB-BSA, (
と と もに2週 間隔 で5回 皮 下 投 与 し, 5回 目の 投
IPP-BSA,
DES-BSAはBPA-BSAと
ほぼ同一
与 か ら2週 間 後 に 得 られ た 抗 血 清 の 抗BPA抗
の 反 応 曲 線 を 描 い た (図7)
。 こ の こ と は, 抗
価 を 比 較 し た 。 抗BPA抗
体
BPAポ
体 産 生 は, C57BL/6
系 マ ウ ス に比 較 してC3H/He系
IPP,
DESと
交 叉 反 応 す る こ と を 示 し て い る 。 ま た, DNP-
マ ウ ス は5%の
危 険 率 で 有 意 に低 か った 。BALB/c系
リク ロー ナ ル 抗 体 はBPB,
BSAに
マ ウス と
(146)
対 して も 弱 い結 合反 応 が 認 め られ た 。 な
口 病 誌1992,
表2抗BPAモ 1,
59/2
447
ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体mAb (A B3,
C8,
ク ラ ス,
F1,
H8)
のlgGサ
抗 体価 はBPA-BSAと の結 合 率B/Tが 示 す と きの抗 体 希 釈 率 の逆 数で あ る
図7抗BPAポ
リ クロ ー ナ ル抗 体 とBPA関
プ
L鎖 お よ び 抗 体 価
約50%を
連化
合 物 との 結 合 率B/T
Tは 抗 血 清 原 液 と固 相 化 抗原 の 結 合, Bは 各 希 釈 率 にお け る抗 血 清 と 固相 化 抗 原 の結 合 をEIAに り求 め た 吸 光 度 (0.D.192-610)
よ 図8抗BPAモ
お,
陰 性 コ ン ト ロ ー ル と し て 用 い たBSAと
応 は 全 く認 め ら れ な か っ た 。B/T値
の反
が50%を
B3,
ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体mAb (A1, C8,
F1,
H8)
とBPA--BSAと
の
結 合 率B/T
示
す 抗 体 希 釈 率 の 逆 数 で 比 較 す る と, BPAが25.6, BPBが21.1,
IPPが27.8,
の に, DNPは3.0で 抗BPAポ
DESが30.0で
ある
あ った 。
リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 はBPA関
の ク μ 一 ニ ン グ を 経 て, 五 つ の ハ イ ブ リ ドー マ が
連化合
物 と も 結 合 し, 交 叉 反 応 性 を 示 し た 。 3.抗BPAモ ス, L鎖, 抗BPAポ
得 ら れ,
ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 のIgGサ 力 価 お よび 抗 原 特 異 性
3,
リク ロ ー ナ ル 抗 体 のBPA関
各 ハ イ ブ リ ドー マ の 産 生 す る モ ノ ク ロ ー
ナ ル 抗 体 (ハ イ ブ リ ド ー マ 培 養 上 満)
ブクラ
C8,
F1,
Monoclonal
連化合
物 に 対 す る 交 叉 反 応 性 が 高 い 場 合 に は, BPAの
pingKitを
抗 原 決 定 基 の 構 造 が 決 定 で き な い た め,
IgGサ
抗BPA
モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 作 製 し た 。BPA-OVAを CFAと
と も に2週
ら にBPA-OVAを
間 隔 で5回
1,
皮 下 に 免 疫 し, さ
2b,
C8,
各 モ ノ クP一
抗BPAモ BPA-BSAと
H8がIgG1で,
(147)
ナ ル抗 体 の A
B3とF1はIgG 型 で あ っ た (表2)
。
ノ ク ロー ナ ル抗 体 と固 相 化 抗 原 の 結 合 率B/T (%)
を 各 希釈 率 ご と
に 求 め て 反 応 曲 線 を 作 成 し た (図8)
3回
Isoty-
を 調 べ た と こ ろ,
L鎖 は い ず れ もIgGLκ
腹 腔 内 投 与 し たBALB/c系
液}こ て 融 合 し,
用 い て,
B
した 。 Immunoglobulin
ブ ク ラ ス お よ びL鎖
マ ウ ス の 脾 細 胞 と マ ウ ス 骨 髄 腫 細 胞P3U1を50 %polyethyleneglyco1溶
H8と Mouse
をA1,
.BPA-BSA
448
口病 誌
平 成4年6月
mAb (A1)
mAb (B3)
mAb (C8)
mAb (H8)
mAb (F1)
図9各
モ ノ クロ ーナ ル 抗 体mAb (A1, B 3, C8, F1, H8) と固 相 化 抗原 BPA-BSAの 結合反応 に対 す る遊離抗原 BPA-BSA, BPB-BSA, IPP-BSA, DESBSA,
(148)
DNP-BSAの
阻害
口 病 誌1992,
表3抗BPAモ 対 す るBPA関
と約50%結 ら 求 め,
ノク ロー ナル 抗 体 と固 相化 抗 原BPA-BSAの 連 化 合 物一BSA結 合 体 の50%阻 害 値
そ の 逆 数 を 抗 対 価 と し, 表2に
示 した 。
29で 最 も 抗 体 価 が 高 く, 続 い てC8が27, H8が26, お,
B3が24で
H8が
F1と
最 も低 か っ た (表2)
1,
ル ー プ はB3グ
B3,
C8,
。 ま た,
2.90で,
BPA-BSAの
比 較 しBPB-BSAに
害 の 程 度 が 弱 か っ た 。IPP-BSA, %阻
競合反応か
対 比 はA1が
そ れ ぞ れ5。1, 3.6,
ら, 各 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 に つ い て, 置 換 曲 線 を
C8が3.3,
3.8,
作 製 し た (図9)
3、8と ほ ぼ 等 し い 相 対 比 を 示 し た 。
遊 離 抗 原BPA-BSA,
IPP-BSA,
DES-BSA,
DNP-BSAの
。 い ず れ の モ ノク ロー ナル 抗 体
も低 濃 度 のBPA-BSAに け て い た 。BPB-BSA,
IPP-BSA,
B3,
BPAの
F1,
B3が8.9,
5.9,
ブ ク ラスお よび 抗 原特 異 性 の ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 (A1, H8)
が得 られ た 。 いず れ の
モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 に お い て も, IPP-BSA,
抗 原 決 定 基 に は 水酸 基 を置 換 基 に もつ フ
BSA,
ま た, BPA関 か ら, A1,
BPAモ
H8の
グ ル ー プ とB3,
の グ ル ー プ に 大 別 され た 。 す な わ ち, プ はBPB-BSA,
IPP-BSA,
A1グ
DES-BSAに
はIPP-BSA,
DES-BSAと
ルー
ル ープ
IV.考
察
比 較 しBPB-BSAに
1)
H8と
固 相 化 抗 原BPA-
の 結 合 反 応 に 対 す るBPAお
関 連 化 合 物 一BSA結
抗 原 決 定 基 に は, 水 酸 基 を 置 換 基 に もつ
った。
A1,
F1,
ほ と ん ど 阻 害 し な か っ た こ とか ら,
フ ェ ニ ル 基 が 深 く関 与 し て い る こ とが 明 ら か と な
1.マ
C8,
抗
BPAの
よ る 阻 害 は 弱 くな っ て い る 。 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 B3,
DES-
F1
ほぼ 同
程 度 の 阻 害 を 受 け て い る の に 対 し, B3グ
固 相 化 抗 原BPA-BSAと
ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 結 合 を 阻 害 し た が,
DNP-BSAは
連化合物 に 対する反応パ ターン C8,
BPB-BSAは
6.5,
H8が5.1,
よ る 結 合 阻 害 は ほ と ん ど 認 め ら れ ず,
ェ ニ ル 基 が 深 く関 与 し て い た 。
BSAと
C8,
よ る阻
害 値 に 対す る相
F1が7.8,
異 な る 五 つ の 抗BPAモ
DES-BSAに
対 し て も 中 等 度 の 阻 害 を 受 け て い る が, DNPBSAに
害 値 のBPA-BSAの50%阻
以 上 よ り, IgGサ
よ り強 い結 合 阻 害 を 受
10で
DES-BSAの50
BPB-BSA,
BPA-BSAと
A1グ
害 値 に 対 す る 相 対 比 は そ れ ぞ れ4。9,
あ り, H8はA1と
F
あ
H8のBPB-BSAの50
%阻 害 値 は そ れ ぞ れ1.43,
に 対 す る 固 相 化 抗 原
C8,
ル ー プ に 比 較 し50%阻
ル ー プ の 中 で も, A1,
50%阻
A1,
F
0.28μ9/wellで
害 値 が 大 き な 値 を 示 し た (表3)
は 全 く反 応 し な か っ た 。
H8 (B/T=80%)
0.21,
よび
モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 の 抗 原 特 異 性 を 検 討す るた め に, モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体A1,
0.16μ9/we11,
そ れ ぞ れ0.29,
り, A1グ
害 値 はB3,
。な
い ず れ の モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 もOVAお
BSAと
1が そ れ ぞ れ0.17,
ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 中 でA1が
449
結 合に
か ら 求 め た 。BPA-BSAの5096阻
合 す る ときの 抗 体 希 釈 率 を 反 応 曲線 か
5個 の 抗BPAモ
59/2
合 体 の50%阻
ウス に お け る抗BPA抗 BPAタ
体 の 産生
ンパ ク結 合体
歯科 材料 が ア レ ルギ ー反応 を生 じるた め に は ま
よ びBPA
ず 歯 科 材 料 が 抗 原 と な る 必 要 が あ る が, 歯 科 材 料
害値 を 置換 曲線
(149)
450
口病 誌
平 成4年6月
そ れ 自 体 は 多 く の 場 合 ハ ピ テ ン で あ り, 単 独 で は
合 モル 比 は 各 ハ プテ ン-キ ャ リア ー 結 合 体 ご とに
抗 原 性 を 示 さず,
決 ま って い る もの の, そ の 範 囲 は比 較 的 広 い こ と
生 体 成 分 (キ
ャ リ ア ー)
と結合
して 初 め て抗 原 性 を 示 す と考 え られ て い る 。 この
が 知 られ て い る。 本 実 験 に お い て 用 い たBPA-
よ うな 場 合 に は, ハ プ テ ン単 体 と と も に 化 学 的 手
OVA結
法 でBSAま
比が 小 さ くて も感 作 性 が 高 く, ヘ ミサ クシ ネ ー ト
た はOVAと
結 合 さ せ た ハ プ テ ン-
合 体 に 関 して はOVAに
対 す る結 合 モル
キ ャ リア ー結 合 体 につ い て の 感 作性 試験 が 行 わ れ
化 され たBPAが
て い る。
と結 合 す る際 に は有 効 な立 体 配 位 を と る もの と思
ハ プ テ ソ を 高 分 子 に 結 合 さ せ る 場 合,
ハプテン
キ ャ リア ー とし て 用 いたOVA
われた。
に遊 離 の カ ル ボキ シ ル基 が ない ときに は あ らか じ
現 在 ま で の と こ ろ, BPAが
ハ プ テ ソ とし て体
め カ ル ボ キ シ ル 基 を 導 入 し て お く必 要 が あ る 。 本
内 に 入 っ て きた ときに そ の キ ャ リア ー の役 割 を 果
実 験 で はBPAの
水 酸 基 と ヘ ミサ ク シ ネ ー トエ ス
た す 物 質 が何 で あ る のか は十 分 に 明 らか に され て
テ ル を 形 成 させ,
カル ボ キ シル基 を導 入 した 。
い な い が, 生 体 内 に は多 くの 種 類 の タ ンパ クが キ
Pyridine溶 drideを
媒 中 でBPAとsuccinic
モ ル 比1:
ャ リア ー とな り うる と考 え られ て い る。
anhy-
3の 割 合 で 反 応 させ,
そ の生
行 っ た 結 果, BPAの
2)
マ ウスの 抗BPA抗
体産生の検討
スポ
化 学 物 質 の 感作 性 を 調 べ る場 合, ハ プ テ ン とな
ッ トは 認 め ら れ ず,
BPAは
そ の ほ と ん どが 反 応
る可 能 性 の あ る化 学 物 質 の 感 作 性 試 験 に は小動 物
し て い た 。BPAを
ヘ ミサ ク シ ネ ー ト化 す る 場
が用 い られ て い る。 本実 験 で は免 疫 学 的 知 見 の 蓄
成 物 に つ い てTLCを
合,
そ の 反 応 部 位 はBPAの
1モ
ル にsuccinic
は,
2モ ル 結 合 す る こ と に な る 。TLCに
BPAを
水 酸 基 な の で,
anhydrideは1モ
ル,
BPA
積 が 多 く, しか もモ ノク ロー ナ ル抗 体 の作 製 に利
あ るい
用 され るマ ウス を用 い た。 ま た, 投与 経 路 は臨 床
お い て,
酢 酸 エ チ ル で 展 開 し た 場 合, Rf値
適用 方法 が 理 想 で あ る が, BPAの
感 作 性 につ い
て はす で に臨 床 報 告 が あ り, 本 研 究 で は抗 原 決 定
は0.92
で あ った 。 カル ボ キ シ ル 基 な どの親 水 性 基 を 有す
構 造 の決 定 な ど, BPAの
る 化 合 物 で は 展 開 が 遅 れ, Rf値
研 究 の 主点 を 置 き, 皮 下 投 与 法 を 採 用 した。
で, Rf値
が0.60お
れBPA1モ
が 小 さ くな る の
よ び0。30の 生 成 物 は, そ れ ぞ
ル にsuccinic
結 合 し た 化 合 物 と2モ
anhydrideが1モ
抗 原 とし ての 特 異 性 に
感 作 成 立 の 有無 を 調 べ る 方 法 に は 細 胞性 免 疫
ル
能, 液 性 免疫 能, マ ク ロ フ ァー ジ機 能, ア レルギ ー反 応 を 指 標 とす る 多 くの 試 験 が あ る23)。 本 研究
ル 結 合 した 化合 物 と考 え ら
の 予 備 的 試 験 に お い て は 細胞 性 免 疫 能 に 関 す る リ
れ た。 本 実 験 に お い て は, BPA1モ cinicanhydride1モ
ンパ 球 幼 若 化 試 験 を 行 った 。BPA-OVA結
ル に 対 し てsuc-
をCFAと
ル が エ ス テ ル 結 合 し たBPA
合体
ともに 足蹠 に注 射 し, 所 属 リンパ 節 で
ヘ ミサ ク シ ネ ー ト を カ ル ボ ジ イ ミ ド 法 に よ り
あ る膝 窩 リンパ節 を 採 取 し, そ の リンパ 節 細 胞 を
BSAあ
BPA, OVAま た はBPA-OVAと と もに培 養 して 3H] thymidineの 取 り込 み を 測 定 した と ころ [
る い はOVAと
BPA-OVAを BPA関
結 合 さ せ,
BPA-BSA,
作 製 して 抗 原 と し て 用 い た 。 また 連 化 合 物 のBPB,
IPP,
OVAに
DESもBPAと
対 す る 反 応 が 強 く, BPAに
特 異 的 な反
同 様 に ヘ ミサ ク シ ネ ー ト化 し た の ち カ ル ボ ジ ィ ミ
応が 検 出で き な か った (未 発 表 デ ー タ) 。 ま た,
ド法 に よ りBSAと
歯 科 材料 に よ る ア レ ル ギ ー はIV型 ア レ ルギ ーで あ
DNFBは OVAに た が, DNPの
結 合 さ せ た 。 こ れ に 対 し て,
直 接DNP基 対 す るBPAの BSAに
をBSAに
対 す るBPA,
結 合 モ ル 比 は 平 均6.2で
り, 感 作 リ ンパ 球 に よ って 媒 介 され る細 胞 性 免 疫
結 合 させ た 。
結 合 モ ル 比 は0.9で BPB,
IPP,
応 答 で あ る が, 感 作成 立 段 階 にお け る抗 原 提 示 細
あっ
胞 の 抗 原 の 取 り込み,
DES,
リンパ 球 へ の 抗 原 提 示 の 過
程 は液 性 免疫 と同一 の過 程 を 経 る と考 え られ る こ
あ った 。 一 般 に,
ハ プ テ ン に 対 す る 免 疫 応 答 を 起 こす の に 適 し た 結
とか ら, bisphenol
(150)
Aの
感 作 成 立 の判 定 は 液性 免
口 病 誌1992,
疫 誘 導 能 を 指 標 と し, 抗BPA抗
体 産生の検討を
devittら24)
は,
L-ala--poly-L-lys [ (T, (
行 った 。本研 究 で は マ ウスにBPAあ る い はBPAOVAを 投 与 す る とき, 被 験 物 質 の 抗 原 性 を高 め
A-L]
る働 きを もっCFAを
に 連 鎖 し, ハ プ ロ タ イ プH-2b,
G) -
に 対 す る 近 交 系 マ ウ ス の 免 疫 応 答 はMHC
型 ア レ ル ギ ー反 応 を 起 こ しや す い モ ル モ ッ トを用 い た感 作性 試 驗 に お いて, BPAと と もにCFAを
DNFB接
投与 し た に もか か わ らずBPAの
2以
感 作 性 は 陰性 で
451
合 成 ポ リペ プ チ ド 抗 原 のpoly-
tyr, glu) -poly-D,
投与 した 。 小 動 物 の 中でIV
59/2
H-2d,
に 高 い こ と を 明 ら か に し た 。 一 方, 触 過 敏 症 のIr遺
H-2kの
順
石 井 ら25) は
伝 子 はH-2お
よ びH-
外 の遺 伝 子 に よる二 重 の 支 配 を受 けて い る こ
あ った とい う報 告 を 踏 ま え, マ ウス に 対 し て は
と を 報 告 し た 。 本 実 験 に お い て, 近 交 系 マ ウ ス に
BPA-OVAの
BPA-OVAを
投 与 回 数 を5回
与 す る際 に は毎 回CFAを BALB/c系
に 増 や し, ま た投
使 用 した 。
マ ウス にBPA単
もに5回 皮 下 投 与 して も抗BPA抗
体 をCFAと
対 す る抗
体 産 生 は マ ウ ス の 系 統 に よ り 異 な り, C57BL/6
と
H-2b) ,
体 産 生 は認 め
られ なか っ た が, BPA-OVA結
投 与 し た 場 合, BPAに
BALB/c (H-2δ) ,
順 に 抗BPA抗
合 体 をCFAと
C3H/He (H-2k)(
体 産 生 が 高 く, BPAに
遺 伝 子 はH-2に
の
対 す るIr
連 鎖 して い る 可能 性 が示 唆 され
と もに皮 下 投 与 す る と抗 体 価 の 上 昇 が 認 め ら れ
た 。 しか し, H-2以
た 。 す なわ ち, BPAは
い る か ど うか は 明 ら か で は な く, さ ら にH-2コ
単 体 で は マ ウ スに抗 体 産
外 のIr遺
伝 子 に も連 鎖 し て
生 を 誘 導 で きな い が, タ ンパ ク と結 合 した 場 合 に
ン ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス や リコ ン ビ ナ ン トマ ウ ス を 用
は, 強 い 免 疫 原 性 を 獲 得 す る こ とが 明 らか とな っ
い た 解 析 が 必 要 で あ る。 マ ウ ス に お い て 疾 患 の 発 症 とH-2と
た 。 また, 追 加 免 疫 以 降 は高 い 抗 体 価 を 維持 して いた 。BPA-OVA結
合体 をCFAと
投 与 し た 場 合, BPA量 つ き, 0.1ngと
と もに50μ1
の 間 に密
接 な 関 係 が 存 在 す る こ とが 明 ら か に され て い る 。 ヒ トの ア レ ル ギ ー 性 疾 患 に お い て も, 花 粉 症 や 喘
は 計算 上, マ ウ スー 匹 に
きわ め て 少量 な の で, ご く微 量 で
息 の よ うに 疾 患 感 受 性 とHLAと
の 相 関が 明 らか
も連 続 的 に投 与 され, か つ タ ン パ ク と結 合 しや す
に さ れ て い る も の も あ る が,
い 状態 に あ る場 合, た と え ば 紫 外線 照射 に よ る
に よ る接 触 過 敏症 は職 業 性 に 発 症 す る 場 合 が 多
BPAの
く, 遺 伝 的 な 解 析 を 行 うの は 難 し い も の と思 わ れ
フ リー ラジ カル 形 成 等 に お い て は感 作 が
る。
成 立 し うる も の と思 わ れ た 。 本 研 究 に よ り, BPA の み な らずBPAの
誘 導 体, あ るい はBPAが
2.抗BPAポ
構
れ る可 能 性 が 示 唆 され た。 BPA-OVA結 BPA抗
リク ロ ーナ ル 抗体 のBPA関
連化合
物 との交 叉 反 応 性
成 成 分 として 入 っ て い る化 合 物 に よ って も感 作 さ
3)
エ ポ キシ レジ ンな ど
抗 原 抗 体 反 応 の 測 定 に は, 疫 電 気 泳 動,
合 体 投 与 マ ウス に お け る抗
EIA)
体 産生 の 系統 差
ゲ ル 内 沈 降 反 応,
放 射 性 免 疫 測 定 法,
免
酵 素 免疫 測 定 法
な ど が あ る 。 ゲ ル 内 沈 降 反 応,
免疫 電 気 (
泳 動 は 広 義 の 沈 降 反 応 で あ り, タ ン パ ク 抗 原 の よ
生 体 の 抗 原 に対 す る免 疫 応 答 はそ の 個 体 の もっ 免疫 応 答 遺 伝 子 (lr遺 伝 子) に よ って遺 伝 的 に規
う な 可 溶 性 で 多 価 の 抗 原 と抗 体 と が 反 応 し て 格 子
定 され て い る。 近 交 系 マ ウ ス は 個体 間 の遺 伝 的ば
状 の 結 合 物 を 生 成 し 沈 殿 す る 反 応 で, 抗 原 決 定 基
らっ き に よ る影 響 を ほ とん ど受 け な い こ とか ら 免
が 限 られ てい る ハ プテ ソに は 適 し て い な い 。 一
疫 系 の遺 伝 解 析 に 利 用 され て い る。
方, EIAは
ハ プ テ ン に も 適 用 で き, 抗 体 あ る い
は抗 原 の標 識 に放 射 性 同位 元 素 を用 い ず に 酵 素 を
同種異 系移 植 に 際 し, そ の 適 合性 を 決定 す る遺 伝 子 領 域 は 主 要 組 織 適 合 遺 伝 子 複 合 体 (MHC)
用 い る も の で,
と呼 ば れ て い る。 マ ウス で は第17染 色 体 上 に位 置
が で き る 。Kitagawaら26)
す るH-2,
は, 抗 生 物 質 の バ イ オ
マ イ シ ン とそ の誘 導 体 に 対 す る抗 バ イ オ マ イ シ ン
ヒ トで は第6染 色 体 上 に 位 置 す るhu-
manleukocyteantigen (HLA)
同 時 に 多 数 の検 体 を 処理 す る こ と
抗 血 清 の 交 叉 反 応 性 をEIAに
で あ る。Mc(151)
よ り検 討 し た 。 そ
452
口病 誌
平 成4年6月
の結 果, バ イ オ マ イ シ ン誘 導 体 の 反 応 曲線 は交 叉
た が って, BPAに
性 の低 い 誘 導 体 で もバ イ オ マ イ シ ンの 反 応 曲 線 と
症 状 を 呈 した こ との あ る患 者 にDESを
平行 性 を 示 し, EIAで
場 合 に は, DESに
求 め た 交 叉 反 応 値 は抗 原
濃 度の 影 響 に よ る変働 が 少 な く, EIAが
交叉 反
応 値 の 測 定 に 有 用 で あ る こ とを 報 告 した 。 BPAお
よびBPA関
連 化合 物 の タ ンパ ク結 合
体 につ い て 分 子 構造 を比 較 し た 場 合, BPB, はBPAと
基 に, IPPで
投与 した
よ る ア レル ギ ー 症 状 が 発 現す
る 可能 性 が 考 え ら れ る。 ま た逆 に, DESに
対す
る ア レルギ ー患 者 にBPAも
誘導
し くはBPAの
体 が 適 用 され た 場 合 に も ア レル ギ ー症 状 が 惹 起 さ れ る 可能 性 が 考 え られ る。
IPP
3.抗BPAモ
同 様 に ヘ ミサ ク シ ネ ー ト化 し, BSA
と結 合 させ た の で, BPBで
す で に 感 作 され, ア レル ギ ー
ノクローナル 抗 体 の 特 異 性 お よ び
BPAの 抗原決定構造 一般 に, 多 価 の 抗 原 で は 得 られ た抗 体 の 交 叉反
は メチ ル 基 が エチ ル
は フ ェ ニ ル基 がHに 置 き換 って い る
点 がBPA-BSAと の 相 違 点 で あ る。合 成 卵 胞 ホ ル モ ン の 一 種 で あ るdiethylstilbestrol (DES)
応 性 が 高 く, 詳 細 な 抗 原 決 定 基 の 解 析 は難 しい と
は 炭 素 間の 二 重 結 合 が あ る もの の, フ ェニ ル基 や
され て い る。 最 近 で は抗 原 特 異 的 な モ ノ ク ロー ナ ル抗 体 が 作 製 され, 抗 原 決 定 基 の 解 析 に 利 用 され
メ チ ル構 造 を もち, BPAと
る よ うに な って きた28)。
構 造 が 類 似 して い る 。
BPAお
よびBPA関
連 化 合 物 一BSA結
BPAポ
リク ロー ナ ル抗 体 と の 結 合 をEIAに
測 定 した と ころ, 抗BPAポ
合 体 と抗
分子 量 が わ ず か に228し か な く, 単純 な 化学 構
て
造 を もっBPAに
リ ク ロー ナ ル抗 体 は
これ ら3種 類 の 化 合 物 と もBPAと
BPA関
ほ ぼ 同一 の 曲
対 す る ポ リク ロー ナル 抗 体 は
連 化合 物 と も交 叉 反 応 性 を 示 し, 抗BPA
ポ リク ロー ナ ル抗 体 とBPA関
線 を 描 き, 抗BPAポ リク ロ ーナ ル抗 体 はBPB, IPP, DESと 交 叉 す る と ころ が 明 らか とな った。
か ら はBPAの
した が って, BPAと
ナ ル抗 体 を 作 製 し, EIAに
で きな か った 。 そ こでBPAに
は 別 の 化 合 物 で も, これ と
共 通 の 化 学 構 造, あ るい は類 似 の 立 体 構 造 を 有す
離 抗 原 の 競 合 反応 か らBPAの
る な らぽ 交 叉 性 を示 す もの と思 わ れ る。
を 行 った 。
Fregertら27) はDESに
連 化 合 物 との反 応
抗 原決 定 基 を 明 らか にす る こ とは
ア レル ギ ー症 状 を 呈す
得 られ た 五 つ の 抗BPAモ
る患 者 に パ ッチ テ ス トを 行 い, BPAや
その他の
対 して, 遊 離 抗 原BPB-BSA,
関 連 物 質 に 対す る 反 応 性 か ら, DESと
交 叉 反応
BSAは
対 す る モ ノク ロー よ り 固 相化 抗 原 と遊 抗原決定基の解析 ノ ク ロー ナ ル抗 体 に IPP-BSA,
固 相 化抗 原BPA-BSAと
DES-
競 合 し, そ の反
性 を 示 す た め の 構 造特 異 性 につ い て, 二 つ の フ ェ ニル 基, フ ェニ ル基 を結 ぶ 炭 素 鎖, お よび 一 つ 以
応 曲線 はい ず れ の モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 に お い て も
上 の 水 酸 基 が 必 要 で あ る と報 告 して い る。 本 実驗
固 相 化 抗 原BPA-BSAと の 結 合 反応 は遊 離 抗 原 BPA-BSAに よ って 強 い 阻 害 を 受 け た が, 遊 離抗
にお い て は, 抗BPA抗 合 して い るIPPと
平 行 性 を 示 した 。抗BPAモ
体 は 水酸 基 が エ ス テル 結
交 叉 した 。した が って, 炭 素 原
原DNP-BSAで
ノ ク ロー ナ ル抗 体 と
は ほ とん ど阻 害 を 受 けな か った
子 を 中 心 と した 二つ の フ ェニ ル基, お よび 水 酸 基
こ とか ら, BPAの
な い し水 酸 基 が エ ス テ ル結 合 し た 化 合 物 はBPA
置 換 基 に もっ フ ェニ ル基 が 深 く 関 与 し て い た 。
やDESの
Leeら29) はinhibition
DESは
交 叉 抗 原 とな りうる もの と思 わ れ る。 エ ス トロゲ ン活 性 を 有 す る 合 成 卵 胞 ホ ル
け るhuman
serum
抗 原 決 定 構 造 に は, 水 酸 基 を radioimmunoassayに albuminに
お
対 す るペ ニシ リ
モ ンで, 前 立 腺 癌 の ホ ル モ ン療 法 な どに 用 い られ
ン の結 合 モ ル比 の 影 響 を 検 討 し, タ ンパ ク に対 す
るほか, 皮 脂 分泌 抑 制 作 用 が あ り, ふ け と り, に
る ハ プ テ ンの 結 合 モ ル 比 が, 得 られ るデ ー タに 大
き び治 療 に外 用 され て い る。 本 実 験 に お い て 抗 BPA抗 体 とDESが 交 叉 反 応 を 示 し, DESは
き な影 響 を及 ぼ し, 添 加 す るハ プ テ ンの 結 合 モ ル 比 が大 き くな る につ れ て 阻 害 活 性 が 強 くな る こ と
BPAに
を報 告 し て い る。 本 実 験 で はBSAに
対 し 交 叉 抗 原 で あ る こ とが示 され た 。 し
(152)
対す る結 合
口 病 誌1992,
モ ル比 はDES,
BPB,
DNP,
BPA,
きか っ た。 一 方, 抗BPAモ BPA-BSAの
IPPの
順 に強 く, DNPで
453
順 に大 V.結
ノ ク ロー ナ ル抗 体 と
結 合 に 対 す る 阻 害 はBPA,
IPP, BPBの
59/2
DES,
Bis-GMAや
論
エ ポ キ シ レ ジ ン に 対 し て ア レル ギ
ー性 接 触 皮慮 炎症 状 を 呈 す る 患 者 が い る
は ほ とん ど阻 害
。 これ
され なか った。 結 合 モ ル 比 を 考 慮 し た 場 合 に, BPAの 次 に 大 きな 阻 害 反応 を呈 した の はIPPで
ら の 化 合 物 の 主 要 構 成 成 分 で あ るbisphenolA
あ り, IPPは
造 を 検 索 す る 目 的 で マ ゥ ス にBPAま
フ ェニ ル基 がHに 置 換 して い る点 を
除 き, 化 学 構 造 はBPA同 やDESに
BPA)
一 で あ る。 また, BPB
ovalbumin結
も水酸 基 を もつ 二 つ の フ ェニ ル基 が あ
る。 これ らの こ と か ら, BPAの
の 感 作 性, 交 叉 反 応 性 お よ ( び抗 原 決 定 構
リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 お よ び モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 と,
抗 原決 定 基 は炭
BPAと
類 似 構 造 を 有 す るbisphenol
素 原 子 を 中 心 とし, 水 酸 基 を もつ 二 つ の フェ ニル
p-isopropylphenol (IPP) ,
基 と メチ ル基 の 立 体 的 な 分 子構 造 体 と 考 え ら れ
ES)
た。 この よ うな こ とか ら, bisphenol
Aの 抗 原 性 に
関 して は, そ の 感 作 能 の 存 在 は従 来指 摘 され て き た が, bisphenolAの
た はBPA-
合 体 を 投 与 し, 得 ら れ た 抗BPAポ
お よ び2,
B (BPB) ,
diethylstilbestrol (D
4-dinitrofluorobenzene (DNFB)
のBSA結
合 体 で あ るBPB-BSA,
DES-BSA,
DNP-BSAと
IPP-BSA,
の 反 応 性 を 酵 素 免疫 測
定 法 に よ り検 討 し, 以 下 の 結 論 を 得 た 。
抗 原決 定 基 お よび交 叉 反 応
1)
BPA単
体 をCFAと
性 に つ い て の 詳 細 な 触 析 は本 研 究 が 最初 であ る。
投 与 し て も抗BPA抗
本研 究 か ら明 らか とな った こ とは, bisphenol
が, BPAつvalbumin結
A
は ハ プ テ ンで あ り, タ ンパ ク と結 合 した場 合 に は
と も にr7ウ ス に5回
体 産生 を 誘導 しえ な か った 合 体 は 抗BPA抗
体 産生
を 誘 導 した 。
感 作 性 が 高 くな り, そ の抗 原 決 定構 造 は 炭素 原 子
2)
を 中心 と した, 水 酸 基 を 有す る二 つ の フ ェニル 基
IPP-BSA,
と メチ ル基 の 立 体 的 な分 子 構 造 全 体 で, BPAと
を 示 した 。 3)
共 通 の 化学 構 造, あ る い は類 似 の 立体 構 造 を 有す
抗BPAポ
リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 はBPB-BSA,
DES-BSA,
IgGサ
DNP-BSAと
交叉反応性
ブ ク ラスお よび 抗 原 特 異性 の異 な る
る化 合物 とは 交叉 性 が あ る とい う こ とで あ る。 し
五 つ の 抗BPAモ
たが って 職 場 や 日常 的 な 生 活環 境 の 中で 数 多 く存
い ず れ の モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 に お い て も 固 相 化 抗
在す る と考 え られ るbisphenolAに
原BPA-BSAと
関 連 す る感
ノ ク ロー ナ ル 抗 体 が 得 られ た 。
抗BPAモ
ノ ク ロー ナ ル 抗 体 の
作 源 お よ び 交叉 抗 原 を 同定 し てい く こ とが 重 要 で
結 合 に 対 す る 阻 害 は, BPA-BSAが
最 も 強 く,
あ る。
IPP-BSA,
DES-BSA,
は 中等 度 で
あ っ た が,
DNP-BSAで
Peltonenら30)
はbisphenolAに
紫 外 線 (UV-
BPB-BSAで
は ほ とん ど阻 害 を受 け
B) を 照射 す る と, フ リー ラ ジ カル が 生 成 す る こ
な か っ た こ とか ら, BPAの
とを 報 告 して い る。Allenら31) は, 戸 外 で 働 く配
基 を 置換 基 に もっ フ ェニ ル基 が 関 与 して い る こ と
管 工 事 者 のBPAに
が 示 唆 され た 。
対 す る光 過 敏 症 を 報 告 した。
また, Maguire32) は マ ウス の耳 翼 腫 脹 反 応 を モ デ ル と し て, BPA光
以 上 の 結 果 か ら, BPAは
過敏 症 を 再 現 す る こ とに 成功
抗原決定基 には水酸
タ ソパ ク と結 合した
場 合 に は 感 作 性 を 獲 得 し, そ の 抗 原 決 定 構 造 は 炭
活性化 さ
素 原 子 を 中 心 と し, 水 酸 基 を 置 換 基 に も っ 二 つ の
れ 生 体 タ ンパ ク と結 合 し, 抗 原 性 を 得 て ア レル ギ ー症 状 を発 現 させ た もの と考 え られ る。 今 後, 光
フ ェニ ル基 とメチ ル 基 の 立体 的 な分 子 構 造 全 体 で あ り, BPAと
過 敏 症 も含 め, キ ャ リア ー とな る 生 体 タ ン パ ク の
立 体構 造 を 有 す る化 合 物 とは 交叉 性 を 示 す もの と
同定 や そ の結 合 の メ カ ニ ズ ム の解 明が 必 要 と考 え
考 え られ た。
した 。 これ らは, 紫 外線 に よ りBPAが
られ る 。
(153)
共 通 の 化 学 構 造,
あ るい は 類 似 の
454
口病 誌
平 成4年6月
謝
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辞
稿 を終 え る に あた り, ご懇 篤 な るご 指導 な らび に ご 校 閲 を 賜 りま した佐 藤 温 重 教 授 に 深 甚 な る感 謝 の意 を 表 し ます 。 また, 本 研 究 を 遂 行 す る に 際 し て, 多 大 な る ご助 言, ご教 示 を い た だ き ま した 本 学 医 用 器 材 研 究所 有 機 材 料 部 門, 中 林 宣 男 教授, な らび に, 本 学 医 学部 第1 病 理 学 教 室, 江 石 義信 講 師 に心 か ら感 謝 致 します 。 さ らに, 本 研 究 に対 し絶 えず ご支 援, ご協 力 を い た だ き ま した 本 学 歯 学 部 第2歯 科 理 工 学 教 室, 医 学部 第 1病 理 学 教室, 医用 器材 研 究 所 有 機 材 料 部 門 の皆 様 方 に厚 くお 礼 申 しあ げ ます 。 本 研 究 の 一 部 は, 平 成1, 補 助 金 (一 般A)
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No.01440078の
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