Z. Lebensm. Unters.-Forsch. 157, 217--220 (1975) © by J. F. Bergmann, Mfinchen 1975

Vereinfachung der Dinitrophenylhydrazin-Methode zur photometrischen Bestimmung yon Ascorbins/iure und Dehydroascorbins~iure in Fruchts/iften I. A n w e n d u n g

bei schwarzem JohanuisbeerstiBmost

Klaus Schmidt und Elis~beth Holfelder Institut fiir Obst- und Gemiiseverarbeitung an der Fachhoehsehule Weihenstephan (BRD) Eingegangen am 9. August 1974 S i m p l i f i c a t i o n of t h e D i n i t r o p h e n y l h y d r a z i n e M e t h o d for t h e P h o t o m e t r i c D e t e r m i n ~ t i o n of A s c o r b i c A c i d a n d D e h y d r o a s c o r b i e A c i d in F r u i t J u i c e s . I. A p p l i c a t i o n t o J u i c e of B l a c k C u r r e n t

Summary. The photometric determination of ascorbic acid and dehydroascorbie acid by preparing the 2,4-dinitrophenylhydrazone derivative of dehydroascorbie acid ~nd purifying it by thinlayerchromatography was simplified snd adapted to the mieroliter system of Eppendorf Ger/itebau, Hamburg, Germany. Using this method with juice of black current, quite reproducible results for vitamin C contents were obtained. Compared with the method of the International Federation of Fruit Juice Producers (titration with 2,6-dichlorphenolindophenol) the contents of vitamin C found with nine different commercial juices of black current were lower from 13 to 300/0. Zusammen]assung. Die 2,4-Dinitrophenylhydrazinmethode (DNPH-Methode) in Verbindung mit der dfinnsehichtehromatographisehen Reinigung des Bis-2,4-dinitrophenylhydrazons der Dehydroascorbins~ure zur photometrisehen Bestimmung der Ascorbins/~ure und der Dehydroascorbins/£ure wird methodisch vereinfacht und an die Arbeitsweise des Mikrolitersystems der Firma Eppendorf angepa~t. Eine Anwendung der Methode bei sehwarzem JohannisbeersiiSmost (Johannisbeersaft, trinkfertig eingestellt) ergab gut reproduzierbare Werte. Verglichen mit der Methode der Internationalen Fruchsaftunion (Titration mit 2,6-Dichlorphenolindophenol) wurden in neun verschiedenen k~uflichen Siil~mosten aus schwarzen Johannisbeeren Vitamin C-Werte gefunden, die um 13--30 ° / n i e d r i g e r lagen. Einleitung Die photometrische Bestimmung des Bis-2,4-dinitrophenylhydrazinderivates der Dehydroascorbins~ure (DAS) zur Ermittlung yon Vitamin C-Gehalten wurde erstmats yon Roe u. Kuether [1] f/ir Blutplasma und Urin, und yon Roe u. Oesterling [2] ffir Extrakte verschiedener Gemfise und Friichte angewandt. Eine Verbesserung der Spezifit~t der Methode erreichten SzSne [3] dureh Anwendung der Papierchromatographie und Stroheeker [4] durch Anwendung der Dfinnschiehtehromatographie zur I~einigung des Bis-2,4-dinitrophenylhydrazinderivates der DAS. Eine Zusammenfassung der ganzen Anzahl yon Modifikationen dieser Methode mit kritischen Betrachtungen hinsichtlieh einer Anwendba.rkeit in derNahrungsmittelpraxis finder man in ,,Vitmine, Chemie und Biochemie" v. Fragner [5]. Eine Anwendung der Methode fiir Vitamin C in Bier wurde kfirzlieh yon Postel [6] ver5ffentlicht. Die im folgenden beschriebene modifizierte 3iethode stellt eine Vereinfaehung und Rationalisierung mit Hilfe des Mikrolitersystems der Firma Eppendorf dar und wurde ~iir die AS- und DAS-Bestimmung in schwarzem JohannisbeersiiBmost angew~ndt. Ffir s~mtlieh Arbeitsschritte werden einheitliche Reaktionsgef~$e aus Kunststoff mit angesetzter VerschluSkappe beniitzt (Inhalt 1,5 ml). Methodik ~

Notwendige t~eagentien und Lgsungen

2 g 2A-Dinitrophenylhydrazin/100 ml 45% ig H2 S Q (0,1 tool), Lsg. I. - - 125 mg 2,6-Diehlorphenolindoph.enol/50 ml H20 (7,7 mmol), Lsg. I I immer friseh berciten. - - 10 g Thioharnstoff/ 100 ml 50°/oig. Athanol (1,3 tool), Lsg. III. - - 8 g Triehloressigs~ure/100 mt H~O (0,5 tool), Lsg. IV. - - 100 mg Ascorbinsgure/11 2°/oige Oxalsgure (0.568 retool), Lsg. V. - - 0xalsgure 2°/oig, Lsg. VI. - - Chloroform, VII. - - Essigsguregthylester, VIII. 1 Herrn Prof. Dr. H. Simon danken wir fiir die leihweise Uberlassung eines K/ivettenwechselautomaten und eines Schreibers zum Filterphotometer der Firma Eppendorf. ~rgulein R. Westermeier danken wir ffir die sorgfgltige Ausfiihrung der Analysen.

218

Analysenvorschri]t Schwarzen Johannisbeersuft mit 2%iger Oxals~ure so verdfinnen, dab eine AS 4- DAS-Konzentmtion yon rd. 50--150 mg pro 1 erreicht wird. Reaktionsprodukte gbzentrifugierten (12000 × g, 4 rain). Den Uberstand fiber ein, zwischen Gef~B und einer siebartig durchlScherten VerschluBk~ppe eingeklemmtes kleines Rundfilterp~pier mit einer Wasserstr~hlpumpe absaugen. Danach das Filterpapier vorsichtig in das Gef~B stoBen. Auf den noch feuchten ~'iederschlag 1 ml Essigs~ure~thylester pipettieren, mit der OriginalverschluBkappe verschlieBen und das rote 2,4-Dinitrophenylhydr~zon der DAS dutch Schfitteln im t~otationsmischer ca. 1 Std extrahieren. Von dieser Essigs~ure~thylesterlSsung mit einer Mikrocapillare 50 ~l auf eine DC-Alufolie Kieselget 60 auftragen und mit Chloroform/Essigsgure~thylester (1 4- 1) 1 Std lang entwickeln.

In das Reaktionsgef~B pipettieren

Konzentration im Test in mmol

Probe (wenn notwendig verdfinnen) 2,6-DichlorphenolindophenollSsung (II)

0,5 ml 0,5 ml

0,1--0,3 2,7

t~eaktionsgef~B verschlieBen und ira Rotationsmischer~ 10 rain schfitteln, danach zupipettieren ThioharnstofflSsung (III) Trichloressigs~ure (IV) 2,4-DinitrophenylhydrazinlSsung(I) ~eaktionsgef~B verschlieBen, im Rotationsmischer 1 min schfitteln and dann im Thermostst~ bei 25° C fiber Nacht oder ca. 15--16 Std incubieren.

0,05 ml 0,05 ml 0,30 ml

46 18 21

Platz ffir insgesamt 24 Reaktionsgef~Be. Die ziegelrote Bsnde abschuben und in einem t~eaktionsgef~13 aus Plastik mit 1 ml H 2 S04 (12 mol) 1/2 Std im l~otstionsmischer extrahieren und yore unlSslichen Kieselgel abzentrifugieren. Die klare rStlich gef~rbte fiberstehende LSsung in Halbmikrokiivetten oder in einer Halbmikrodurchlsufkfivette bei einer Wellenl~nge yon 546 nm in einem geeigneten Photometer gegen einen gleich behandelten Blindwert messen.

Beredmung der Ergebnisse Ep x F x St

Est

-- mg DAS 4- AS pro 1 der unverdfinnten Probe. Ep = Extinktion der Proben-

15sung, Es~ = Extinktion der AS-StsndardlSsung, St = rag/1 AS der StandardlSsung, F = Verdfinnungsfaktor der ProbenlSsung. Diese Arbeitsvorschrift erfaBt die AS und die DAS gemeinsam. Will man die DAS ~llein bestimmen, so ersetzt man in der Arbeitsvorsehrift die 0,5 ml 2,6-Dichlorphenolindophenoll6sung durch 0,5 ml H20. Die Berechnung ist die gleiche. Die AS allein erh~lt man dsnn sus der Differenz. Ergebnisse und Diskussion

~/berpri~/ung der Methode 1 Tell Schwarzer JohannisbeersiiBmost (n~tfirHcher Gehalt a n AS ÷ DAS 212 rag/l) wurde m i t 1 Tefl 2 °/oiger Oxals~ure u n d jeweils zwei Teilen eines A S - S t a n d a r d s 50 rag/l, eines A S - S t a n d a r d s 125 rag/1 u n d eines A S - S t a n d a r d s 200 rag/1 gemischt u n d gemessen. Wie aus Tab. 1 hervorgeht, wurde die dem schwarzen JohannisbeersiiBmost zugesetzte Menge AS zu 9 8 - - 110 % wieder gefunden. I n einem weiteren Versuch w n r d e die R e p r o d u z i e r b a r k e i t der W e r t e m i t 5 verschiedenen A S - S t a n d a r d s 33,5; 50; 100; 125 u n d 200 mg/] getestet. Die in Tab. 2 zusammengefaBten Ergebnisse l~ssen es vorteilhaft erscheinen, die B e s t i m m n n g s p r o b e n m i t 2 %iger Oxalsaure so zn verdfinnen, dab ein AS 4. DAS-Gehalt y o n ca. 100 mg/l erhalten wird. Die mitt]ere Abweichung der E i n z e l b e s t i m m u n g bei d e n 100, 125 u n d 200 rag/1 A S - S t a n d a r d s b e t r a g t 6--.7 rag.

219

Ergebnisse mit schwarzem Johannisbeersiiflmost N e u n schwarze Johannisbeers£fte verschiedener tterstellerfirmen, w u r d e n m i t der Methode der I n t e r n a t i o n a l e n F r u c h t s M t u n i o n (Titration m i t 2,6-Dichlorphenolindophenol) [7] u n d m i t der modifizierten 2 , 4 - D i n i t r o p h e n y l h y d r a z i n m e t h o d e auf ihre Tabelle 1. Bestimmung yon Ascorbins~ure und Dehydroascorbinsgure in schwarzem JohannisbeersiiBmost nach Zusatz versehiedener AS-Standards Mischung (1 + 1 + 2) aus Extinktion schwarzem Johannisbeerbei siiBmost (212 rag/1 546 nm AS -~ DAS), Oxalsiiure 2°/oig und drei AS-Standards

AS-Standard 50 rag/1 AS-Standard 125 mg/1 AS-Standard 200 rag/1

0,175 0,275 0,360

Ascorbins£ure -~ Dehydroaseorbins£ure Gehalt der Mischungen rag/1

Ascorbins~uregehalt der zugegebenen Aseorbins/iurestandards wieder gefunden mg/1

%

77,5 122 159

49 138 212

98 110 106

Tabelle 2. Der mittlere und wahrscheinliche Fehler des Mittelwertes der Ascorbins~urebestimmung naeh der modifizierten 2,4-Dinitrophenylhydrazinmethode, gemessen mit versehiedenen Aseorbinsi~urestandards (Mittelwerte aus 4 Bestimmungen) Ascorbinsiiure Standardl6sungen rag/1

Extinktion bei 546 nm

33,3 50 100 125 200

0,064 0,113 0,227 0,277 0,453

Mittlerer Fehler % ~ 9,5 ±11,0 :J: 2,8 ± 3,8 -4- 3,5

Wahrscheinlicher Fehler % ±6,4 ~:7,4 ±1,9 ±2,5 ±2,4

AS bzw. AS- u n d DAS-Gehalte n n t e r s u c h t . Vergleicht m a n die Ergebnisse der beiden Methoden i n Tab. 3, so findet m a n m i t der I F U - M e t h o d e bei einzelnen S/iften bis zu 30 % h6here AS-Gehalte. Zweifelsohne ist die D N P I t - M e t h o d e i n V e r b i n d u n g m i t der Dfinnsehiehtehromatograptfie der T i t r a t i o n m i t 2,6-Diehlorphenolindophenol i n gef/irbten SMten u n d Sfil3mosten a n Genauigkeit u n d Spezifitgt/iberlegen. Tabelle 3. Ascorbins~ure- und Dehydroascorbins~ure-Bestimmungen naeh der modifizierten 2,4-Dinitrophenylhydrazinmethode und nach der Methode der Internationalen Fruchtsaftunion (IFU) in sehwarzen JohannisbeersiiBmosten verschiedener Herstellerfirmen Schwarzer Johannisbeersfifimost

Bestimmung nach der 3{ethode der IFU Aseorbinsgure

Nr.

~Bestimmung nach der modifizierten 2,4-Dinitrophenylhydrazinmethode Aseorbins~ure + Aseorbinsgure I)ehydroaseorbins~ure rag/1 mg/1

1 2 3 4 5 6 7 8 9

403 189 138 161 157 594 260 183 163

505 242 162 222 141 687 293 202 2O2

375 176 132 153 148 583 234 176 156

rag/1

220

Anmerkung zur Spezi/it~it der D N PH-Methode Die D-Araboascorbinsgure (Isoascorbins~ure) wiirde, wenn vorhanden, bei der DNPH-Methode miterfaBt werden. Zur Niterfassung der 2,3-Diketogulons~ure wgre folgendes zu sagen: Naeh Arbeiten yon E1 Khadem et al. [8] bildet die DAS in saurer LSsung mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin das Bis-(2,4-dinitrophenylhydrazon) der DAS, das dunkelrot gef~rbt ist. Nur unter alkalisehen Bedingungen wird diese Verbindung in das Bis-(2,4-dinitrophenylhydrazon) der 2,3-Diketogulons~ure umgewandelt, das dann seinerseits unter sauren Bedingungen zum 1-(2,4-dinitrophenyl)-3-(trihydroxypropyl)-4,5-(pyrazoldion)-4- (2,4-dinitrophenylhydrazon)weiterreagieren kann. Letztere Verbindung ist or~ngegelb gefgrbt und kann unter sauren Bedingungen auch direkt aus der 2,3-Diketogulonsgure und 2,4-Dinitrophenylhydrazin gebildet werden. Die oben genannten Autoren zeigen auch, dag dutch Jod das Bis-(2,4-dinitrophenylhydrazon) der DAS bei 85° C in 5--10 rain zu einem Azohydrazon oxidiert werden kann. Da bei einer chromatographischen Trennung der 2,4-Dinitrophenylhydrazonedie rot gefArbte Bande zur Bestimmung herangezogen wird, mul~ diese Bande das Bis-(2,4-dinitrophenylhydrazon) der DAS enthalten. Ob das 2,4-Dinitrophenylhydrazonproduktder 2,3-Diketogulonsgure das orangegelb gef~rbt sein soll, die gleichen chromatographischen Eigenschaften hat, wurde yon uns nicht nachgeprfift. Vorteile der modi/izierten D:VPH.Methode im Vergleich zu /ri~heren A~'beitsweisen (z. B. [4]j: 1. Die Extraktion fiberschiissigen 2,6-Dichlorphenolindophenols mit Di~thyl~ither nach Oxidation yon AS zu DAS entfallt. 2. Abfiltrieren des I~iederschlages und Extrahieren des Bis-phenylhydrazons mit Essigsaureathylester linden im gleichen Reaktionsgefi~l~ start. Dabei entfallt das Filtrieren mit Glasfiltertiegeln, Sauberwaschen des l~iederschlages, Aufnehmen des Niederschlages in Essigs~ure~thylester, Einengen der Essigs~iure~thylesterl5sung bis zur Trockene und Aufnehmen des l~iickstandes in einem bestimmten Aliquot Essigs~ureathylester. 3. Die auf die DC-Platten aufzutragende Menge an LSsung ist stark reduziert worden (Einsp~ren yon DC-Platten). 4. Die zu m~nipulierendenFlfissigkeitsmengen liegen zwischen 0,05 und 1 ml und sind mit Hilfe yon Eppendorfpipetten und Mikrok~pillaren leicht, schnell und genau zu handhaben. 5. Die klcinste mit einer Genauigkeit yon ± 20/0 Fehler (mitt]ere Abweiehung vom Mittelwert) bestimmbare Ascorbinsi~uremenge ist 50 ~g unter den angegebenen Bedingungen. (Diese Menge liel~esich dureh iimderung der Bedingungen etwa um den Faktor 10 verringern.)

Literatur 1. 2. 3. 4. 5.

l~oe,J.H., Kuether, C.A.: J. Biol. Chem. 147, 399 (1943) Roe, J.H., 0esterling, M.J.: J. Biol. Chem. 152, 511 (1944) Sz6ne, K.: Nahrung 4, 825 (1960) Strohecker, R., jr., Pies, H.: Z. Lebensm. Unters.-Forsch. 118, 394 (1962) Fragner, J.: Vitamine, Chemie und Biochemie, Bd. I, S. 427. Jena: Gustav Fischer VerIag VEB 1964 6. Postel,W.: Brauwissenschaft 25, 354 (1972) 7. Analysen der Internationalen Fruchtsaftunion, Analyse Nr. 17. W~denswil/Schweiz: Eidgen. Forschungsanstalt 1964 8. E1 Khadem, H., Meshreki, M. I-I., E1 Ashry, H. S., E1 Sekeili, M. : Carbohydr. Res. 21, 430 (1972) Dr. K. Schmidt E. ttolfelder Institut fiir 0bst- und Gemfiseverarbeitung an der Fachhochschule Weihenstephan D-8050 Freising-Weihenstephan Bundesrepublik Deutschland