Histochemistry 45, 177--190 (1975) 9 by Springer-Verlag 1975

Zur Entwicklung des Gallenblasenepithels des Meerschweinchens I. F / i r b e r i s c h - l i c h t m i k r o s k o p i s c h e u n d k o h l e n h y d r a t - h i s t o c h e m i s c h e Untersuchungen T. H. Schiebler*, K. L a n g u n d T. W a h l i n * * Anatomisches Institut der Universitg~t Wtirzburg, Wfirzburg, Bundesrepublik Deutschland Histologisehe Abteilung und Pathologisches Institut der Universit~t, Umes Schweden Eingegangen am 15. Mai 1975 The D e v e l o p m e n t of t h e Guinea P i g Gallbladder E p i t h e l i a l Cells I. Light Microscopical and Carbohydrate-histochemical Investigations

Summary. The development of the guinea pig gallbladder epithelium was studied from the 19th day of intrauterine life to the 31st postnatal day by means of histological and histochemical staining reactions. At first, the epithelium is a columnar pseudostratified one. Its transformation into a simple columnar eptihelium is terminated by the 31st day of the intrauterine life. Then the epithelial cells become more columnar and their nuclei acquire a basal position. Somewhat later the epithelium invaginates the underlying mesenchyme. Up to the 57th day the epithelium contains much glycogen. Neutral and carboxylated mucosubstances are demonstrable after the 30th day. From the 48th day onwards su]phated mucosubstances can be visualized in some cells in the depth of the invaginations and from the 51st day in the epithelial cells of the gallbladder. "Light" mueoid cells appear first in the epithelium of day 58. After the 6th postnatal day the "light" cells are rarely seen in the invaginations. The development of the gallbladder epithelium is completed about the 10th postnatal day.--The epithelial mueosubstances of the gallbladder of the adult animal could be classified as GCmucins and S-mucinsA, 1.0 MgC12. Zusammen/assung. Es wird die Entwicklung des Gallenblasenepithels des Meerschweinchens yore 19. Embyonaltag (ET) bis zum 31. Lebenstag (LT) f/~rberisch-liehtmikroskopisch und histoehemisch untersucht. Das zun/~chst mehrreihige Zylinderepithel wird bis zum 31. ET einschichtig. In der Folgezeit werden die Epithelzellen hoehprismatisch und die Kerne wandern nach basal. Aulterdem entstehen Epithelbuchten. Das Gallenblasenepithel enth~lt zun~chst viel Glykogen, das bis zum 57. ET wieder versehwindet. Ab 30. ET k6nnen im GMlenblasenepithel neutrale und carboxylierte Mucosubstanzen nachgewiesen werden. Ab 48. ET treten in der Tiefe der Buchten und ab 51. ET in allen Gallenblascnepithelzellen sulfatierte Mucosubstanzen auf. Ab 58. ET kommen im Gallenblasenepithel ,,aufgehellte" mucoide Zellen vor, die nach dem 6. LT nur noch in den Buehten zu finden sind. Abgeschlossen ist die Entwicklung des Gallenblasenepithels etwa am 10. LT. - - Bei den epithelialen Mucosubstanzen im Gallenblasenepithel des erwaehsenen Meerschweinchens handelt es sich um GC-Muzine und S-Muzine A, 1,0 MgC12. * Herrn Prof. Dr. W. Graumann, Direktor des Anatomischen Instituts der Universit~t Tiibingen, in herzlicher Verbundenheit, mit den besten Wfinschen zum 60. Geburtstag gewidmet. ** Mit Unterstiitzung dureh Swedish Medical Research Council (Grant No. B 73-12X-3932-01) und einer Beihilfe durch die Universit~t Umes 1 Histochemistry

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T.H. Sehiebler et al.

Einleitung Das Gallenblasenepithel produziert Glykoproteine (Werner, 1953 ; Wallraff und Dietrich, 1957; Spicer und Meyer, 1960; K. Y a m a d a , 1960, 1962a, b; WolfHeidegger et al., 1965; Luciano et al., 1974; Wahlin et al., 1974; Inferrera und Ferlazzo, 1974, u.a.), die ins G~llenblasenlumen abgegeben werden. Das Ziel vorliegender Untersuchungen ist es, Auftreten und Lokalisation dieser Mucosubst~nzen im Gallenbl~senepithel des Meersehweinehen~ w~hrend der Entwicklung liehtmikroskopisch-histoehemisch zu effassen. Einschl~gige Arbeiten feblen bisher. Ebenso sind Studien fiber die ttistogenese der Gallenbl~se des Meersehweinchens k a u m durchgefiihrt worden (Jmdsch, 1909; Ishikawa, 1950). Auch hier soll unsere Untersuehung die erforderlichen Erg~nzunge~ bringen. Dureh die Bestimmung des ZeRpunktes, an dem d~s Gallenblasenepithel des Meerschweinchens morphologisch und histoehemiseh dem erwachsener Tiere entspricht, hoffen wir zu Rfieksehlfissen auf die Funktionsa~fnahme des Gallenblasenepithels zu komm e n . - Alle unsere Untersuehungen basieren auf einer genuueren Kenntnis der Histologie und Histochemie des Gallenblasenepithels erwaehsener Meersehweinehen (Jurisch, 1909; D'Agatu, 1911; Gompper, 1951; Spicer, 1960; H a y w a r d , 1962; K. Yamad~, 1962~, b ; Tusques et al., 1964; Mueller et al., 1972; I ~ e r r e r ~ und Ferlazzo, 1974). Auch hier bestehen noch Lficken in unserem Wissen.

Material und Methodik Untersucht wurden die Gallenblasen yon 106 Meerschweinchen [60 embryonale Tiere, 22 Tiere vom 1.--31. Lebenstag (LT), 24 ausgewachsene Tiere]. Vom 19. und 23. Embryonaltag (ET) stammten ie 1 Tier, yore 27. ET 5 Tiere, 30. ET 2, 31. ET 8, 33. ET 2, 36. ET 3, 40. und 44. ET je 2, 48. ET 8, 49. ET 2, vom 50. ET 1 Tier, 51. ET 2 Tiere, 53. ET 4, 55. ET 5, 58. ET 3, vom 60. ET 1 Tier, vom 62. ET 2 Tiere, 63. ET 6 Tiere, Bei der Altersbestimmung wurde vom Konzeptionstermin bzw. yon der Scheitel-Steil~-L~nge (SSL) ausgegangen. Vom 1. LT verwendeten wir 2 Tiere, vom 3., 4 , 5., 6. je 1 Tier, veto 10., 11., 12. je 2 Tiere, vom 15., 16., 17., 20., 24. LT je 1 Tier, vom 25. und 27. LT ]e 2 Tiere und yore 31. LT 1 Tier. Die Fixierung der Gallenblasen effolgte fiberwiegend in Bouin'scher LSsung, gelegentlich in einem Gemisch aus 40 % Formalin und absolutem Alkohol im Verh~ltnis 1 : 9, 10 % Formalin, Susa, Formol-Caleium, Carnoy, Helly, Ro~man und Gendre. Paraffineinbettung; Schnittdicke 5--7 ~Lm;Kryostatschnitte (10 ~m) nach Fixierung in 10% Formalin. t~egelm~iflig ausge]i~hrte Fiirbungen und Realctionen. F~rbung naeh Goldner (1938), Perjods~ure-Sehiff-Reaktion (PAS, MeManus, 1946) mit und ohne Amylasevorbehandlung (1 Std, +37~ Spieer et al., 1967), Alcianbl~u pH 1,0 (Lev und Spicer, 1964), Alcianblau (pI-I 1,0)-Perjods~ure-Schiff-Reaktion (Mowry, 1963), Dichlorpseudoisocy~nin (Schiebler und Schiessler, 1959) Aldehydfuehsin-Aleianbl~u (pit 2,5, Spicer und Meyer, 1960), Methylenblaupufferf~Lrbung pH 3,5 und 4,5 und ~inhydrin-Schiff-Re~ktion (Pe~rse, 1968). Weiterhin wurden Pr~p~rate, aber regelm~Big nur yon embryonalen Gallenblasen, methyliert (4 Std bei 60~ 0,4 em3 konzentrierte I-IC1in 50 em3 absolutem Methanol; Spicer und Lillie, 1959), dureh Verseifung demethyliert (1%ige KOH in 70 %igem Alkohol, Lillie, 1958; Spicer, 1960) und anschliel]end mit Aldehydfuchsin-Alcianblau gef~rbt (Spicer und Meyer, 1960). AuBerdem wurden h~Lufig folgende F~rbungen und Reaktionen verwendet: Alcianblau unter Berfieksichtigung der kritischen Elektrolytkonzentration (AB-CEC; Scott und DoSing, 1965), Aleianblau, pH 2,5 (Pearse, 1968), Alcianblau (pH 2,5)-Perjods~ure-Sehiff-Reaktion (Mowry, 1963), Aldehyd~uehsin (I-Ialmi und Davis, 1953) und Azur A, pH 1,0--4,5 (Spieer et al., 1967). Weitere Reaktionen zur Charalcterisierung der Mucosubstanzen. Vorbehandlung der Sehnitte mit Neumminidase (Worthington Biochem. Corp., 0,05% in 0.1 M Phosphatpuffer, pH 6,0; 12 Std 37~ K. Yamada, 1970), Amylase (Sigma, 0,1%, in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,0; 1 Std, 37~ Spicer et al., 1967) und Hyaluronidase (Sigma, 0,05% in 0,1 M Phosphatpuffer,

EntwieMung des Gallenblasenepithels des 3~eerschweinehens. I

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pH 5,5; 4 Std, 37~ Leppi und Stoward, 1965). Als Kontrollen dienten mit enzymfreiem Puffer inkubierte Sehnitte. Die mi~ Enzymen vorbehandelten Sehnitte wurden mit Aleianblau (pH 1,0 und pH 2,5) und PAS gef~rbt. Befunde Entwicklungsgeschichtliche Untersuchung

1. EmbryonMzeit 30. E T . Das Lumen der Gallenblase erseheint im Querschnitt fast rund and wird iiberwiegend yon einem dichten mehrreihigen, stellenweise einsehichtigen Zylinderepithel ansgekleidet (Abb. 1). Die Kerne der Epithelzellen sind grog und rund, manchmM abgeflacht und ffillen h/~ufig den Zelleib bis auf einen schmMen Cytoplasmasaum ans. Das Cytoplasma fi~rbt sich nur schwaeh an. Mitosen kommen in geringer Zahl vor. Eine zarte Basalmembran kann mit Hilfe der PAS-Reaktion dargestellt werden. Unter dem Epithel befindet sich lockeres Mesenchyrn. Histochemie (Tabelle 1). Das Cytoplasma des Gallenblasenepithels ist PASpositiv, basal kr~ftiger als apikal (Abb. 2). Der gr6Bte Tell dieses Materials, besonders basal und subapikal, kann durch Amylase digeriert werden. Offenbar handelt es sich um Glykogen. Nach Amylasebehandlung verbleibt apikal eine sehr zarte positive PAS-Reaktion. Dieses Gebiet f/~rbt sieh mit AldehydfuehsinAleianblau (pH 2,5) sehwaeh blau, mit Aleianblau (pH 1,0)-PAS zart rot an. Die Aleianblauf/irbung (pit 1,0) f/~tlt negativ aus. Es werden wahrseheinlieh neutrale and earJooxylierte Mueosubstanzen d a r g e s t e l l t . - Das apikale Cytoplasma and die BasMmembran zeigen ferner eine kr/~ftige, das basale Cytoplasma eine abgesehw~ehte metaehromatisehe Reaktion mit Diehlorpseudoisoeyanin.Die Ninhydrin-Sehiff-Reaktion f/illt im apikalen und basalen Cytoplasma sehwach positiv a~s. 81.--64. ET. Im Vordergrund steht w~hrend dieser Zeit die Morphodifferenzierung. Histoehemiseh kommt es gegeniiber vorher zu keinen grundsgtzlichen Veriinderungen, jedoeh nehmen Mle Reaktionsintensit~iten zu. 31. E T . Das Epithel ist einschichtig hochprismatisch. Die Kerne liegen in der Zellmitte. Sie sind unver/indert groB, iiberwiegend oval und locker strukturiert. Das Cytoplasma gliedert sich in folgende Zonen: apikM, snbapikal, supranucle/~r und Basal (vgl. Wahlin et al., 1974). Die starkste Anfgrhnng zeigt in der Regel der unmittelbar nnter der lumenw/~rtigen Oberflgche gelegene Zellabschnitt. Supranucle/~r fallen bei einigen Zellen Aussparungen auf. Basal ist das Cytoplasma stark aufgelockert und hut helle Bezirke. Eine BasMmembran kaml nun aueh mit der Goldner-F/irbnng dargestellt werden. An einigen Stellen der GMlenblasenwand deuten sich Buehten an. 33. und 26. E T (Abb. 3). Es kommen eine Anzahl flaeher Buehten vor. Die Epithelzellen sind hbher geworden, stehen aber noeh sehr dieht nebeneinander. Die Zellkerne haben 1/ingsovMe Form. In einigen Epithelzellen kommt es zn einer Verdiehtung des apikMen, in anderen zu einer des basalen Cytoplasmas. Mitosen sind h/iafig; die Kernteilung erfolgt bevorzngt in den apikalen Zellbezirken. Eingestrent kommen im Epithel sehmale Zellen mit langgestreektem Kern vor, yon denen einige besonders dieht sind. - - Snbepithelial treten Kapillaren auf.

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T. tI. Schiebler et al.

Abb. 1.30. ET. Das GallenblasenepRhel des Meerschweinchens wird yon einem dichten mehrreihigen Zylinderepithel mit runden bis abgeflachetn Kernen gebildet. Apikal im Epithel findet sich eine Mitose (Pfeil). Bouin, Goldner. Vergr. 880fach Abb. 2.33. ET. Starkes Glykogenvorkommen vor allem im basalen Cytoplasma. Bouin, PAS otme Diastasebehandhmg. Vergr. 160lath. Abb. 3.36. ET. Die Keme haben eine liLngsovale Form und sind nach basal gewandert. Rechts im Bild eine flache Bucht. Bouin, Goldner, Vergr. 880fach Abb. 4.48. ET. In den Buchten linden sich Epithelzellen mit kriiftiger Alcianb]au (pH 1,0)PAS-Reaktion. Im Pr~parat kommen blau- und rotgefgrbte Zellbestandteilenebeneinander vor. Bouin, Alcianblau (pH 1,0)-PAS. Vergr. 450fach

40. E T . Das C y t o p l a s m a der Epithelzellen ist d i c h t e r geworden, besonders apikal. Einige Zellea sind snpranucle/ir a n d a p i k a l s t a r k anfgehellt (Golgifeld ?). - Vereinzelt t r e t e n im M e s e n c h y m d e r G a l l e n b l a s e n w a n d g l a t t e )/[uskelzellen auf, die sich laufend v e r m e h r e n , his a m 44. E T ein aufgelockertes, a n g e d e u t e t zirkul~r verluufendes Muskelfasergeflecht vorliegt. 45.--63. E T . In dieser Zeit steht die Chemodifferenzierung im Vordergrund der Entwicklung, obgleich auch noch eine weitere morphologische Differenzierung erfolgt.

Entwicklung des Gallenblasenepithets des Meersehweinchens. I

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Tabelle 1. Die Chemodifferenzierung des Gallenblasenepithels des Meersehweinchens wghrend der Entwicklung Histoehemisehe Reaktion

30. ET--44. ET

4:5. ET--63. ET

1. LT

10. LT

PAS Amylase-PAS AB (pH 1,0)-PAS AB (pH 1,0) AF-AB (pH 2,5)

d(d-) (d-)g -(d-)B

+d-ddd-gB dd-tI,B

-t-d-4-dd-d-RB d- dd- d-l:~B

d-d-@ d- -4-d+d-d-RB d- d- -td-d-d-RB

d-d(d-) (d-)R -(+)B

d-dd- -4+d-P~B d- dd- d-RB

PAS = Perjodsgure-Sehiff, AB = Alcianblau, AF = Aldehydfuchsin. d- -4-d- = starke Reaktion, d-d- = mggig starke Reaktion, d- = sehwaehe Reaktion, (-4-)= sehr sehwaehe Reaktion, = negative Reaktion, I~ = rote Farbung, B = blaue F~;rbung. -

-

48. E T . Die Buehten im Gallenblasenepithel sind tiefer als z u v o r . - Die H6he der Epithelzellen hat zugenommen, ihre Kerne liegea basal uad augerdem k5rmen Schlul31eisten gesehea w e r d e n . - Histochemie (Tabelle 1). In Epithelzellen einiger Buchten ~reten iiberwiegend apikal and subapikal Alcianblau (pH 1,0)positive Mucosubstanzen anf, an gleieher Stelle fallen die PAS- und Aleianblan (pH 2,5)-PAS-l~eaktion positiv aus. Bei der Alcianblan (pH 1,0)-PAS-F/~rbung (Abb. 4) finder man blaa and rot gefs Bestandteile nebeneinander; mit Aldehydfuehsin-Aleianblau (pH 2,5) erfolgt eine P u r p u r f ~ r b u n g . - Weniger auffgllig sind die F/irbungen in den iibrigen Epithelzellen. Mit AldehydfuchsinAlcianblau (pH 2,5) wird apikal ein schmaler Streifen blau, der iibrige Tell diffus purpur angefgrbt. Mit Aleianblau (pH 1,0) erfolgt keine F ~ r b u n g . - Bei der Methylenblaupufferf/irbung (pit 3,5 und 4,5) und der Ninhydrin-Schiff-Reaktion verhalten sieh alle Epithelzellen gleieh. Mit Methylenblau (pH 3,5) fiirbt sieh das Cytoplasma insgesamt gleiehm~gig, bei p H 4,5 basal kr~tftiger als apikal. Bei der Ninhydrin-Sehiff-Reaktion ist die apikale Zone etwas intensiver als die basa]e d a r g e s t e l l t . - Mit Dichlorpseudoisocyanin reagiert das am Lumen befindliehe Epithel kr/~ftiger metaehromatiseh a]s das der Buehten. 51.--55. E T . In nahezu allen Epithelzellen ist das apikale Cytoplasma verdichtet. Einige haben VorwSlbungem Vereinzelt kommen im Gallenblasenepithel sehlanke, kr/~ftig gef/~rbte Zellen mi~ 1/ingliehem, re]ativ diehtem Kern v o r . Histochemie (Tabelle 1). Am 51. ET f/trben sieh zan/ichst einige Epithelzellen apikat sehwaeh mit Aleianblau (pH 1,0), in der Folgezeit (55. ET) immer mehr; aul3erdem nimmt die Farbintensit/~t zu. Bei der Aleianblau (pH 1,0)-PAS-F/~rbung kommen blau- und rotgef~rbte Zellbestandteile subapikal, apikal und in den Cytoplasmavorw61bungen nebeneinander vor. - - Glykogen ist am 51. und 53. ET noeh nnverandert vorhanden. Am 55. E T ist dagegen das Gallenblasenepithel bei 2 yon 4 untersaehten Meerschweinchen glykogenfrei and am 58. ET ist im Galleablasenepithel kein Glykogen mehr zu linden. 58.--63. E T . Das Gallenblasenepithel ist einsehichtig. Es besitzt viele Buehten und Falten. AuBer den typischen hochprismatisehen Epithelzellen, deren Cytoplasma in der l~egel apikal verdiehtet ist, tretea zun/iehst in den Buehten, dana aber aueh im Oberfl/iehenepithel ,,aufgehellte" Zellen auI (ABb. 5--8). Das Cytoplasma dieser Zellen ist nur sehwaeh gefgrbt. Sie bilden teils Oruppen yon

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T.H. Schieb]er et al.

Abb. 5--8. ,,Aufgehe]lte" Zellen Abb. 5.60. ET., ,Aufgehellte" Zellen liegen tells in Gruppen, teils einze]n zwischen den iibrigen EpithelzeUen. Bouin, Goldner. Vergr. 560Iach Abb. 6.63. ET. In einer Bucht kommen zahlreiche ,,aufgeheUte" Zellen vor (Pfeil). Bouin, Goldner, Vergr. 560fach Abb. 7. 63. ET. Alcianblau (pH 1,0)-PAS. Kr~ftige PAS-Reaktion in fast allen ,,~ufgehellten" Zellen. Vergr. 160fach Abb. 8.63. ET. Bucht im Gallenblasenepithel mit ,,aufgehellten" Zellen (Pfeil). Bouin, Goldner. Vergr. 560fach

3 4 Zellen, liegen aber aueh einze]n zwischer~ den iibrigen Epithelzellen. Ferner haben wir im Eloithel ganz vereinzelt Basalzellen (oder Leukozyten) mit dichtem rundem Kern und hellem Cytoplasma sowie sehlanke dunkle Zellen beobaehtet. Mitosen sind im Oberfl~chenepithel vor allem am 58. ET h / t u f i g . - Histochemie (Tabelle 1). Sieht man yon der Mange der naehweisbaren Mueosubstanzen und den Farbintensits ab, gleieht das histoehemisehe Verhalten des Epithels immer mehr dem erwaehsener Tiere. Insbesondere f~rben sich mit Ausnahme der ,,aufgehellten" Zellen die Epithelzellen apikal deutlich mit Aleianblau (pH 1,0) an. Die ,,aufgehellten" Zellen dagegen haben nur eine minimale Aleianblau (pH 1,0)F/~rbung; sie werden vielmehr bei der Aleianblau (pI-I 1,0)-PAS (Abb. 7) und mit

Entwicklung des GMlenblasenepithels des Meerschweinchens. I

183

PAS deutlieh rot. Nach Vorbehandlung mit Amylase vergndern diese Zellen ihre PAS-Reaktion nicht. Offenbar J0esitzea die ,,aufgehellten" Zellen fiberwiegend neugrale und earboxylierte Muzine. - - Bei der Methylenblaupufferf~rJ0ung (pH 3,5 und 4,5), der Diehlorpseudoisocyanim und der Ninhydrin- Sehiff-ReaktioI1 bestehert keirte Untersehiede zwischen den ,,aufgehellten" Zellen und den ii~0rigen Epithelzellen. - - Die sehmalen dunklea Zellen, die seit dem 51. E T vereinzelt vorkommen, sind sehwaeh PAS-positiv. Die PAS-I~eaktion ist Amylase-resistent. Mit Ninhydrin-Schiff reagieren sie kr/iftig. Bei der Aleianblau- und der AldehydfuehsinAleianblau-Fgrbung verhalten sieh diese Zellen wie die anderen Gallenblasenepithelzellen. 2. Postnatalzeit Die ersten 10 Lebenstage dienen noch weitgehend der Ausdifferenzierung das Gallenblasenepithels. Dann entspreehen die Verh~ltnisse denen erwachsener Tiere. Veri~nderungen, die sparer auftreten, diirften funktioneller Natur sein. Die Gallenblasen aller untersuehten Tiere sind am 1. LT wall mit einer wasserklaren Fliissigkeit gel/lilt. In der Folgezeit weehselt der Ftillungszustand der Gallenblase und der Inhalt verf/trbt sieh yon Tug zu Tug zunehmend grtinlieh. - Histologisch zeigen die Gallenblasen, besonders his zum 10. LT, bald eine gedelmte, bald eine gefaltete Sehleimhaut. Bei Dehnung sind alle Falten nnd Buchten verstrichen. Die in der Tiefe der Buehten gelegenen Zellen werden an die freie Oberfl/~ehe gezogen. ])as Eloithel wird kubiseh. Sobald sieh die GMlenJolasenwand wieder in :Falten und Buehten legt, ein Zustand, der naeh dem 10. LT und Joeim erwaehsenen Tier die Regel ist, ist das Epithel wieder hoehprismatiseh. Die Zellen selbst erseheinen bei allen histologisehen Fgrbnngen diehter als pr/inatal und zeigen die typisehe Zonengliederung. Die Kerne sind rued his oval und in der Regel locker strnkturiert, sie haben mehrere Nneleoli. Bei abgeflaehtem E10ithel liegen die Kerne nahezu in der Mitre, bel hoehprismatisehem im basalen Drittel der Zellen. Die Zahl der Mitosen im Gallenblasenepithel nimmt gegenfiber den letzten Embryonaltagen stark ab und vermindert sieh mit fortsehreitendem Lebensalter weiter. - - Die Zellen mit aufgehelltem Cytoplasma, die kurz vor der Geburt in groBer Zahl vorkommert, nehmen naeh der GeJourt ab. A5 10.LT kommen sie nur noeh ganz vereinzelt in der Tiefe yon Buehten vor. - - Die sehmalen dunklen Zellen linden wit regelm/tGig und dentlieh erst wieder in den Gallenblasen naeh dem 10. LT. Histochemie. Die Ver/inderungen sind in der gegel bereits vor der Geburt eingeleitet worden. Wit finden bei der Aleianblau (pH 1,0)-PAS-geaktion in allen Epithelzellen oberhalb des Kerns ia gr6Berer Zahl vermiseht nebeneinander blau und rot gef/~rbtes Material (Abb. 9). Je glter die Tiere werden, umso mehr konzentrieren sieh die blau gef~rbten sulfatierten Mueosubstanzen auf die apikale Zellzone, ohne allerdings snbal0ikal vollst/~ndig zu versehwinden (AJob. ll). Am 6., sp/~testens am 10. LT eI~tsloreehen die Verh/~ltnisse denen erwachsener Tiere. Bis dahin hut auch die Intensit/it aller Reaktionen stark z u g e n o m m e n . - Die auff/illigsten Ver/~nderungen erfahren die ,,aufgehellten" Zellen. Umnittelbar naeh der Geburt (1. und 2. LT) bekommen viele dieser Zellen, die bisher bei der Aleianblau (pH 1,0)-PAS-F~rbung intensiv PAS-rot gef~rbt waren, eine purpurblaue Misehfarbe. In den ns Tagen gleiehen sieh diese Zellen noeh mehr den fibrigen Epithelzellen an, so dub mit Ausnahme weniger Zellen in der Tiefe yon

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T.H. Schiebler et al.

Abb. 9. 2. LT. Alcianblau (pit 1,0)-PAS. Das apikale Cytoplasma der Gallenblasenepithelzellen ist im Pr~par~ blau- und rotgef~rbt. Vergr. 350fach Abb. 10. Erw~chsenes Meerschweinchen. Alcianblau pI~I 2,5. Kr~ftige ]~eaktion des apikalen Cytoplasmasaums. Die Alcianblauf~rbung(pH 2,5) nimmt yon apikal nach basal an Intensitiit ab. Vergr. 560fach Abb. 11. 10. LT. Alcianblau (pH 1,0)-PAS. Im Pr~para~ fiberwiegt apikal und subapikal die blaue Anf~rbung. N~ch basal nimmt die blaue Farbe zugunsten einer zart roten ab. Vergr. 560fach Abb. 12. Erwachsenes Meerschweinchen. Kr~ftige PAS-l~eaktion im apikalen Zellsaum. In einigen Epithelzellen reagiert such der sub~pikale und supranucle~re Zellbereich kri~ftig. Bouin, PAS. Vergr. 560fach

Entwicklung des GallenblasenepitheIs des Meerschweinchens. I

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Buehten am 6 , sp/~testens am 10. L T keine Zellen nur mit neutrMen und carboxylierten Muzinen im Gallenblasenepithel des Meerschweinchens zu erkelmen sind.

Erwachsene Meemchweinchen Histochemie (Tabelle 2). Die IntensitAt der Alcianblau (pH 1,0)-Fi~rbung n i m m t in dell Epithelzellen yon apikal anch basal ab. Gleiches gilt ffir die Alcianblau (pH 2,5)-F/trbung (Abb. 10) und PAS-l%eaktion (Abb, 12) jedoch mit dem Unterschied, daI3 Fi~rbung und Reaktion subapikal die gleiche Intensit~t haben wie apikal und aui3erdcm basal noch PAS-positives Material v o r k o m m t . Bei der kombinierten Alcianblau (pH 1,0)-PAS-Reaktioll (Abb. 11) entspricht das F a r b m u s t e r dem der Einzelf~rbung. Alcianblau-positives und PAS-positives Material k o m m e n nebeneillander vor; apikaI und subapikal fiberwiegt das blaugef~rbte, nach basal n i m m t es zugunsten des roten ab. Die metachromatische l%eaktion mit Azur A ist bei p H 4,0--4,5 subapikal und supranuclei~r am krMtigstea. Die Azurophilie bei p H 2,0 ist alkoholresistent, w~hrend die Metaehromasie bei p i t 4,0--4,5 alkohollabil ist. Bei Anwendung der Alci~nblauf/~rbung mit kritischer Elektrolytkonzentration (Tabelle 3) f/~rbt sich das Epithel apikal noch bei einer MgC12-Konzentration yon 1,0 M, subapikal dagegen n u t bei einer K o n z e n t r a t i o n yon 0,4 M MgC12. Vorbehandlungen der Pri~parate mit Amylase, Neuramidase und Hyaluronidase beeintr~chtigen die Reaktionen n i e h t . - I n vielen Epithelzellen der Buehten beschr~nkt sich der krt~ftige Ausfall der Alcianblau (pH 1,0)-F~rbung der P A S - R e a k t i o n nieht rmr auf die oberstert Cytoplasmaabschnitte.

Tabelle 2. Histochemische Reaktionen im Gallenblasenepithel des erwachsenen Meerschweinchens Histochemische Reaktion PAS AB (pH 1,0) AB (pH 2,5) AB (pH 1,O)-PAS AB (pH 2,5)-PAS azur A (pH 1,0) Azur A (pH 1,5) Azur A (pH 2,0) Azur A (pH 3,0) Azur A (pH 4,0) Azur A (pH 4,5) Amylase-PAS Neuraminidase-AB (pH 1,0) Neuraminidase-AB (pH 2,5) Hyaluronidase-AB (pH 1,0) Hyaluronidase-AB (pH 2,5)

Epithel apikal ++-}A-+-}_]_++ ++-]-RB +-}- + R B ---+ + Metach. + + Metach. + ++ + ++ ++ + ++ + ++ +

subapikal + ~--}++ _u~__}_ ++RB + + -}-RB (+) + + ++ + + + Metach. ++++Metach. + ++ ++ ++ + + + ++ +

supranucl~r

basal

+ (+) + _ul~ +RB (+) + + + + + Metach. ++Metach. + (+ ) + (+) +

+ -_ +t~ -_ -_ ---+ -----

+ +-4- + = sehr starke Reaktion, d- + + = starke Reaktion, + + = m~Ll3igstarke Reaktion, + =schwache l~eaktion, ( + ) = s e h r schwache Reaktion, --=negative Reaktion, l~=rote F~rbung, B = blaue F~rbung, AB = Alcianblau.

186

T.H. Schiebler et al.

Tabelle 3. Reak~ionen yon Alcianblau mit kritischer Elektrolytkonzentration im Gallenblasenepithel erwachsener Meerschweinehen Mol. MgCI2 0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,8

1,0

Apikal Subapikal

+++ +(+)

++ +

++ +

+(+) (+)

+ (+)

+ --

+ --

+++ ++

Diskussion

Unsere Untersuchung zeigt, dab sich alle wichtigen Entwicklungsschritte beim Gallenblasenepithel des Meersehweinchens zwisehen dem 30. E T und 10. LT abspielen. Vor dieser Zeit fehlen dem Gallenblasenepithel morphologisehe und histoehemische Charakteristica. Im Mittelpunkt der Entwicklung steht die Zeit vom 45.--63. ET. Naeh der Geburt wird die Entwicklung lediglieh zu Ende geftihrt. Damit erweist sieh das Meersehweinchen auch hinsichtlich seiner Gallenblasenentwicklung als typiseher Nestfliiehter: his zur Geburt ist die Entwieklung im wesentliehen abgesehlossen. Verh/iltnisse, die denen erwaehsener Tiere gleiehen, werden sehon am 10. LT erreieht. Typiseh ffir die Entwieklung des Gallenblasenepithels zwisehen dem 30. und 44. E T ist das Tiefertreten der Kerne nnd die Ausbildung einer Zellgliederung. Gleiehzeitig nimmt die HShe der Zellen zu und es kommt zu zahlreiehen Mitosen. Eigenartig ist, dab sich die Kernteilungen fast aussehlieBlieh in den apikalen Zellbezirken abspielen. Nach Ferner (1949) runden sich die Epithelzellen, die sieh zur Teilung anschicken, ab ;sie 15sen ihre basale Verankerung nnd wandern an die Epitheloberflgehe. Verantwortlich hierffir sol1 Platzmangel in der Basalzone sein; oberflaehlich bestfinden grSSere Entfaltungsm6gliehkeiten. Histoehemiseh lassen sich zwischen dem 30. und 44. ET im Gallenblasenepithel in langsam zunehmender Menge earboxylierte und neutrale Mucoproteine nachweisen. Diese liegen in den Epithelzellen apikal nnd subapikal, sind Amylaseresistent PAS-positiv und f/~rben sich mit Aldehydfnchsin-Alcianblau (pH 2,5), nieht jedoeh mit Aleianblau (pit 1,0). Methylierung mit ansehliegender Verseifung vor der Aldehydfuchsin-Aleianblau (pH 2,5)-Reaktion ffihrt zu einer verst/~rkten purpurblauen F/~rbung in den apikalen Zellabsehnitten (vgl. zur Interpretation der histoehemisehen Resultate Spicer und Meyer, 1960; Lev und Spicer, 1964; Pearse, 1968). Zwischen dem 30. und 57. ET kommt im Gallenblasenepithel des Meerschweinehens reichlieh Glykogen vor (vgl. Wahlin und Sehiebler, 1975; Elektronenmikroskopie). Es tritt in tier Frfihzeit tier Entwicklung auf, nimmt damn an Menge zu - - insbesondere zwischen 45. und 55. ET - - , um bis zum 58. E T wieder vollstandig zu versehwinden. Der grSgte Teil des Glykogens liegt snbapikal und basal (vgl. aber Ishikawa, 1 9 5 0 ) . - Die Bedeutung des Glykogens ffir das Gallenblasenepithel des Meerschweinchens w~hrend der Entwieklung ist unklar. Nach Heiderich (1914), Plenk (1931, 1932) und Seeliger (1937) kann Glykogen fiir den Aufbau yon kohleahydratreiehen Sehleimen, nach Graumann (1964) ffir die Bildung yon Hexosephosphaten verwendet werden. Aadere Antoren (Sasse, 1968) nehmen an, da$ enge Beziehungen zwisehen Glykogenabbau und Biosynthese yon Nueleins/~uren nnd damit dam Aufbau kSrpereigene Strukturen bestehen. Weitere

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(Needham et al., 1937; O'Connor, 1950) halten das Glykogen in der Embryonalzeit ftir einen endogenen Energietr/~ger. Mit fortschreitendem Wachstum versehwindet das Glykogen (Janosky nnd Wenger, 1956). Dann treten vermehrt exogene Energiequellen in Funktion (Spratt, 1952). In diese Vorstellung wiirde ffir das Gallenblasenepithel die Beobachtung passen, dab das Glykogen dann abgebaut ist, wenn das endgiiltige Enzymmuster weitgehend vorliegt (Wahlin und Sehiebler, 1975). Auch hinsichtlich der Mucosubstanzen ist die Zeit zwischen dem 45. und 63. ET besonders interessant. Am 48. ET haben wir erstmalig in Epithelzellen yon Buchten stark saure sulfatierte Glykoproteine nachweisen kSnnen. Sie lassen sieh deutlich mit Alcianblau (pH 1,0) anf~rben. Auger den sulfatierten kommen in diesen Zellen neutrale und earboxylierte Mucosubstanzen vor. Wir finden n/imlich, dab dies Material Amylase-resistent PAS-positiv reagiert und mit Aldehydfuchsin-Alcianblan (pH 2,5) und Aleianblau (pI-I 2,5)-PAS purpur angef/irbt wird. Ffir die weitere Entwieklung ist charakteristisch, dab immer mehr Epithelzellen sulfatierte Muzine enthalten ; am 51. ET sind es auger den Zellen in den Buehten noch verh~ltnismiigig wenige, am 55. ET sehon wesentlich mehr, am 58. ET nahezu Mle und am 63. ET gleicht diesbezfiglieh das Gallenblasenepithel weitgehend dem erwaehsener Tiere. Offenbar gewinnen zwischen dem 45. und 63. ET immer mehr Gallenblasenepithelzellen die F/ihigkeit, sulfatierte Mueosubstanzen zu bilden ohne dabei die Produktion neutraler und carboxylierter Glykoproteine aufzugeben. Fiir die Sulfatierung der Mucosubstanzen scheint das supranuelei~re Cytoplasma eine besondere Rolle zu spielen, da nur oberhalb dieser Region die stark sauren Muzine gefunden werden. Supranuele/~r liegt beim Gallenblasenepithel der Golgi-Apparat (Wahlin und Schiebler, 1975; vgl. K. Yamada, 1962a), der naeh Peterson und Leblond (1964), Lane et al. (1964), Berlin (1967), Rambourg et al. (i 969) u.a. ftir die Sulfatierung yon Schleimsubstanzen verantwortlich ist. Ahnliehes hat erstmMig Graumana (1959) fiir Beeherzellen dargelegt. Er hat gefunden, dab zun/iehst neutrMe Sehleimstoffe gebildet werden, die dann supranncleSz verestert werden und somit sauren Charakter bekommen. Eine ander Frage ist, wie im Gallenblasenepithel das wiederholt apikal und subapikal beobaehtete gleiehzeitige Vorkommen yon Alcianblau (pit 1,0)gef/irbtem und PAS-rot reagierendem Material gedeutet werden soll. Prinzipiell ist denkbar, dag nebeneinander Muzingranula vorkommen, die nut saure, und solehe, die nur neutrMe Muzine enthMten. Ob dies aber tats/~ehlich der Fall ist, dfirfte aueh elektronenmikroskopiseh sehwer zu entscheiden sein. Eine Sonderste]lung nehmen die ,,aufgehellten" Zellen im Gallenblasenepithel ein. Sie treten etwa am 58. ET auf, ihre Zahl wird nach der Geburt geringer uud naeh dem 6. LT und beim erwaehsenen Tier finder man sic nut noeh in der Tiefe weniger Buehten. Die ,,anfgehellten" Zellen bilden meist kleine Grulopen zwisehen den iibrigen Epithelzellen. F/irberiseh fallen sie durch ihr helles Cytoplasma, histochemiseh bei der PAS- und der Aleianblau (pH 1,0)-PAS-Reaktion durch Rotfitrbung auf. Mit Aldehydfuehsin-Aleianblau (pH 2,5) und Aleianblan (pH 2,5)-PAS tSnen sie sieh purpur. Bei der Alcianblau (pH 1,0)-F~trbung erseheinen diese Zellen fast wie ausgespart zwisehen den iibrigen Epithelzellen. Offenbar besitzen diese Zellen nentrale und earboxylierte aber kaum sulfatierte Mueosubstanzen.

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T.H. Sehiebler et al.

Nach unserer Meinung sind die ,,aufgehellten" Zellen mit den ,,tonnenfSrmigen" Zellen yon Jurisch (1909) und K. Yamada (1962b) identisch. Von elektronenmikroskopischen Untersuchungen (Wahlin und Schiebler, 1975) wissen wir, dab es sich um mucoide Zellen haadelt, die in verschiedenen Funktionsstadien vorkommen. Es sind jedoch keine Becherzellen (Wahlin und Schiebler, 1975, aber Aschoff und Bacmeister, 1909). Im iibrigen ist das tempor~re Auftreten yon Drfisenze]len mit hervorstechenden histochemischen Eigenschaften wi~hrend der Entwicklung nichts ungewShnliches, z.B. beschreibt Grauma~n (1964) in der Glandula submandibnlaris neugeborener Mguse Zellen, die am 2. LT erscheinen, durch ihre perjodatreaktiven, metachromatischen Substanzen auffallen und sparer wieder v e r s c h w i n d e n . - Itinsichtlich der auch yon uns beobachteten sehlanken d~nklen Zelle~ (,,Stiftzellen") m6chten wir ohne elektronenmikroskopische Untersuchung (Wahlin nnd Schiebler, 1975) keine neue Interpretation zu den bereits bestehenden hinzuffigen (vgl. Aschoff, 1905; Jurisch, 1909; Ferner, 1949). Die Entwicklung der Gallenblase des Meerschweinchens nach der Geburt dient der funktionellen Ausreifung. Nut manche Epithelzellen scheinen vor der Gebnrt zur Sekretion befi~higt zu sein (vgl. Wahlin und Schiebler, 1975). Ein Hinweis auf die postnatal zunehmende Sekretion gibt die Beobachtung, dab der Gallenblaseninhalt, der zun~chst farblos ist, stark zunimmt. Spielt fiir Menge uad Farbe der Galle sicher in erster Liaie der Beginn der Leberfunktion eine Rolle, so sprechen doch alle unsere Befunde daffir, dab such das Gallenblasenepithel selbst Stoffe in die Galle abgibt. Hierbei diirfte es sich um saure Mucosubstanzen handeln. Auch beim erwachsenen Meerschweinchen kommen im Gallenblasenepithel apikal und subapikal Schleimstoffe vor. Diese epithelialen Muzine sind resistent gegen Neur~minidase, Hyaluronidase und Amylase. Die positiven Reaktionen yon Alcianblau (pH 1,0) nnd Alcianblan-CEC bei hohen Konzentrationen yon MgC12 (bis 1,0 M MgC12) deuten darauf hin, daI~ diese Mucosubstanzen Sulfatgruppen enthalten (vgl. Spicer et al., 1967 ; Pearse, 1968). AuBerdem f~rbt sich das Epithel stark mit Alcianblau ( p g 2,5), Alcianblau mit niedriger Elektrolytkoazentratio.a (0,1 M MgCl~) und metachromatisch mit Azur A bei p H 4,0--4,5. Diese Resultate sprechen dafiir, dab die Schleimstoffe auch Carboxylgruppen enthalten. Ffir das Ga]lenblasenepithel des erwuchseaen Meerschweinchens gilt daher, da[t in den Zellen ein Gemisch aus sulfatierten, neutralen und carboxylgruppenreichen Mucosubstanzen vorkommem Nach der gfiltigen Klassifikatioa der Mucosubstanzen (Spicer et al., 1965; Pearse, 1968) dfirfte es sich hierbei um GC-Muzin A, 0,1 M MgC12 und S-Muzin A, 1,0 M MgCl~ handeln. Literatur

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