Originalarbeit- Experimentelle Untersuchung

Emflug stat~scher magnet~scher Felder auf die Aktivitfit yon Osteoblasten: eine In-vitrO2Untersuchung M. A. Papadopulos 1, I. H6rler 2, H. Gerber 2, B. A. R a h n 2, Th. R a k o s i 1 Universit~tsklinik far Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde, Polildinik far Kieferorthop~idie 1 ()~rztlicher Direktor: Prof. Dr. Th. Rakosi), Freiburg, mad Laboratorium ffir experimentelle Chirurgie 2, Schweizerisches Forschungsinstitut (Leiter: Prof. Dr. S. Perren), Davos, Schweiz

Vom'ag, gehalten auf der wissenschaftlichen Jahrestagung der Deutscher~ Gesellschaft far Kieferorthopfidie 1990. Endgt~Itige A~mabme des M~rtuskripts: 5.6.1992. 218

9 Urban & Vogel Fortsehr., Kieferorthop. 53 (1992), 2t8-222 (Nr. 4)

Papadopulos et al.: Einfluf3 magnetischer Felder auf Osteoblasten E~aleitung Im Verlauf der letzten Jahre haben die Permanentmagnete das Interesse der Kieferorthop~iden geweckt und fanden immer gr6gere Anwendungsbereiche. So verwendeten einige Autoren [1, 6, 7, 9, 10, 13] Samarium-Cobalt-Magnete (SmCo5) ~ r die Bewegung yon Einzelz~ihnen. Dellinger [3] trod Kiliardis et al. [11] haben bei Menschen, Woods und Nanda [18] bei Tieren ein mit Plattenapparaturen kombiniertes Magnetsystem verwendet, um offene Bisse zu behandeln. ~&nliche Magnetapparaturen wurden yon Graber [8] und Vardimon et al. [16] zur Behandlung von Mesial- und Distalbigfgllen eingesetzt. Eine weitere Anwendung fanden die magnetischen Kr~ifte bei Vardimon et al. [15] zur Gaumennahtsprengung bei Macaca4ascicularis-Affen.

(800 g, 5 rain) und in BGJ mit 10 % FCS (Fa. Gibco) resuspendiert und mit einer Zelldichte von 5 x 105 Zellen/Schale inkubiert. Die Schalen wurden willktirlich auf die verschiedenen Magnetkonfigurationen verteilt. Alle 48 Stunden wurde das Medimn (BGJ, 10 % FCS, 50 rag/m1 Askorbat (Fa. Fluka) zur Hfilfte ersetzt. Nach 21 Tagen wurde die alkalische Phosphatase (ALP) als Parameter ffir die Osteoblastenneubildung histochemisch mit dem ,,Alkaline Phosphatase Kit 4# 85L-2" (Fa. Sigma Diagnostics) nachgewiesen.

Magnetfeldkonfigurationen Die statischen magnetischen Felder mit einer Intensitat von 178mT (Millitesla) wurden von 10 x 10 • 2ram groBen Neodynium-Magneten (Fa. Medical magnetics) erzeugt.

)

Im Gegensatz zu konventionellen Kraftsystemen, wo der Kraftanstieg bzw. -abfall proportional mit der Kraftaktivierung zunimmt, ist der Kraftanstieg bei Magnetsystemen exponentiell [3, 6, 7, 9, 10], wodurch die orthodontische Zahnbewegung schneller erfolgt. Es stellt sich daher die Frage, ob diese vorteilhaffe Auswirkung auf die Zahnbewegung und den Knochenumbauvorgang allein auf die mechanische Eigenschaft der Magnete zur~ckgeffihrt werden mug oder ob die magnetischen Felder zus~tzlich einen direkten EinfluB auf die Aktivitfit yon Osteoblasten haben.

Material und Methode

Ge winnung Jet Osteoblasten Kalvarien wurden 20 Tage alten Rattenembryonen desselben Weibehens entnommen. Es wurden jeweils nut die Embryonen einer Mutter verwendet, die auf die vier Versuchsgruppen zuf~illig verteilt wurden (keine Zellmischung). Insgesamt wurden 111 Kalvarien verwendet. Die Weichteile wurden enzymatisch mit 2 mg/ml Kollagenase (Fa. Worthington) und lmg/ml Trypsin (Fa. Worthington) in physiologischer Salzl6sung nach Tyrode ohne Ca 2+ und Mg2+ (TBSS) wghrend 30 Minuten im Seh0ttelwasserbad (38 ~ 150 rpm) enffernt. Anschliel3end wurden die Kalvarien grtindlich mit TBSS gewaschen und fiber Nacht im Brutschrank (Fa. Heraeus, 5 % CO2, 95 % relative Feuchtigkeit) in BGJ (Fa. Gibco) mit 2 mg/ml Kollagenase inkubiert. Andertags wurden die herausgel6sten Zellen abzentrifugiert 9 Urb;m& Vogel Fortscb.r.Kieferorthop.53 (i992), 218-222 (Nr. 4)

Es wurden vier verschiedene Magnetkonfigurationen verwendet: a) Zellkulturen unter dem Einflul3 anziehender Magneten (Gruppe A, n = 11), b) Zellkulturen unter dem Einflug abstol3ender Magneten (Gruppe B, n = 10), c) Zellkulturen unter dem Einlfuf3 entmagnetisierter Magneten (Gruppe C, n = 11), d) Zellkulturen unter keinem magnetischen Einfiufl (Gruppe D, n = 9). Die Gruppen C und D dienten als Kontrol|e. Die Mao gnete der Gruppe D wurden durch Erwgrmen der Magnete bis zu ihrer Curie-Temperamr von 274 ~ entmagnetisiert. Da dabei die Beschichtung dieser Magnete zerst6rt wird, wurden sie mit Polyurethan neu beschichtet, um die Korrosion w~hrend des Experiments zu verhindern. Die Magnete wurden mittets Wachsschablone in einem Abstand yon 10mm unter den Petri-Schalen positioniert. Um den Abstand zwischen Magneten und Zellen m&glichst gering zu halten und die Intensit~t des magnetischen Feldes volt auszunutzen, wurden Petriperm-Schalen (Fa. Haereus) verwendet (Abb. 1). Nach 21 Tagen wurden die Pr~iparate makro- und mikroskopisch yon zwei Untersuchern analysiert trod die optische Dichte Nr jedes t ~ p a r a t mit dem Belichtungsmesser ,,Flash Meter III" (Fa. Minolta) gemessen. Der MeBfahrer bestand aus einer 2 x 2,5-mm4ilizium-Fotozelle mit einer Meggenauigkeit von +_ 0,2 Be219

Papadopubs et aL : EinEufl magnetischer Felder auf Osteoblas~en b) Osteoblasten unter dem Einfluf3 eines homogenen bzw. heterogenen Fe ldes und c) Osteoblasten unter dem Einfluf3 homogenen Feldes in horizontaler bzw. vertikaler Richtung.

[ Medium 25~m hydrophile ~iofolie

l [Vkl~rl~,~ 1

[ W~ch$bo$i$1

Abb. 1. VersucKsanordnung. lichtungswer~en (EV). Die Messungen wurden an 15 verschiedenen Stellen pro Prfiparat durchgefahrt (Abb. 2). Die Prfiparate wurden auf emem Leuchtkas~en mit maximatem Belichtungswert 17 aufgelegt und das durchgehende Licht yon einer Fotozelle mit Digitalanzeige gemcssem Je mehr alkalische Phosphatase yon den Osteoblasten produziert wurde, desto intensiver war die Fgrbung und desto weniger Licht konnte yon der Fotozeile reg~striert werden. Die Belettchtungsverh~ltnisse yon zwei LJchtquellen (bier Zellkulturen) ist nach Angaben des Herstellers des Beiichtungsmessers unter folgender Formel zu definieren:

Ergebnisse In 'allen Versuchsgruppen zeigren die Osteoblasten ~hnliche Zellfm~nen ohne Ausrichtung nach den Magnetfeldlinien. Die makroskopische Beur'Leilung beschr~mkte sich auf die Bestimmung der Intensit~t der atkatischen Phosphataseanf~rbung. Sie wurde bei allen Zellkulturen im magnetischen Feld (Gruppe A/B) trod den Kontrotlkulturen (Gruppe C/D) durchgeffihrt. Die Messung der optischen Dichte ergab im Durchschnitt 16.55 Belichtungswerte (EV) ~ r die Gmppen A und B sowie 16.60 Belichtungswerte (EV) Nr die ~ibrL gen Gruppen (Abb. 3). Das heiBt, dag die Osteoblasten im magnetischen Feld msgesamt um 3,5 % aktiver waten als die Kontrollkulturen Dieser Gruppenunterschied war nicht signifikant.

BeleuchtungsverhNtnis = 2 (Beliehtungswert1- Belichtungswert2) Die Ergebnisse der Densitometrie wurden statistisch mit der ,Varianzanalyse" ausgewertet und auf signifikante Unterschiede ~iberpr~J~k (Signifikanzniveau p < 0:05). Foigende Vergleiche wurden durchgefphrt: a) Osteoblasten unter dem Einfluf3 statischer magnefisc~er Felder mit beiden Komrollgruppem

rachsbasisI

Nur bei Vergteich der Kulturen mit anziehenden (Gruppe A: 16,60 EV) und emmagnetisierten Magneten (Gruppe C: 16.54EV) wurde deI gegenteilige Effekt beobachtet, das heiBt, in diesem Fall waren die Osteoblasten, die nicht magnetischem Einflug unterlagem um 4,2 % aktiver als die den Magneten ausgesetzten (Abb. 3). Diese Differenz war jedoch statistisch nicht auffallig. Ansonsten ergab der Vergleich zwischen den ZellkuImren mit abstoflenden (Gruppe B: 16.50EV) Ur~d mit enmu~gnetisierten Magneten (Gruppe C 16,54 EV), dab die unter dem magnetischen Einflug stehenden Osteoblasten am 2.8 % aktiver waren als unbeeinflugte Osteoblasten (p < 0,05, nicht signifikant) (Abb. 3). Auch waren ZetJkulturen, die anziehenden Magnewn ausgesetzt waren (Gruppe A: 16,60EV), gegen•ber unbeeinflugten Osteobiasten (Gruppe D: 16.66MV) um 4,2 % aktiver (p < 0,05, nicht signifikant) (Abb. 3).

Magne'~e ] Abb.2. Die Posit~onder d-tt:rchgefalartenMesstmgen(weigeQuadrate) der Densi~ometrieam Prfiparat. 220

Zetlkutturen, die absroflenden Magnewn aasgesetzt waten (Gruppe B: 16,50 EV), waren gegeniiber der Kontrollkultur (Oruppe D: 16,66 EV), um 11,7 % aktiver. Aach das war statistisch nicht signifikant (p < 0,05) (Abb. 3). 9 Urban &Voget Foctsch~'...Kd.eferor~hop.53 (!992),2!8-222 (Nr.4)

Papadopulos et al.: Einflufl magnetischer Felder auf Osteoblasten 17,0~

Zwischen den Zellkulturen unter Einflug eines in vertikaler Richtung homogenen magnetischen Feldes und denen unter EinfluB eines in horizontaler Richtung homogenen Feldes wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt.

16,816,6-

EV 16,4 16,2 16,t3

A

B

C

D

Abb. 3. Ergebnisse der Densitometrie. A = Gruppe A, anziehende Magnete (~ = 16,60 • 0,21), B = Gruppe B, abstoBende Magnete (~ = 16,50 _+ 0,16), C = Gruppe C, entmagnetisierte Magnete (~ = 16,54 + 0,25), D = Gruppe D, ohne Magnete (~ = 16,66 • 0,23), EV = Belichttmgswert (exposure value).

Ahnliche Gruppenunterschiede wurden auch zwischen den Zellkulturen mit anziehenden bzw. abstoBenden Magneten und zwischen den Zellkulturen mit entmagnetisierten MagnetCn bzw. ohne Magnete festgestellt. Bei Vergleich der Ausschnitte der Zellkulturen, die unter EinfluB eines homogenen magnetischen Feldes standen, und denen, unter dem EinfluB eines heterogenen Feldes wurden makro- und mikroskopisch keine signifikanten Unterschiede festgestellt. Die Messung der optischen Dichte ergab im Durchschnitt 16,49 Belichtungswerte (EV) far die erstgenannte Gruppe und 16,52 Belichtungswerte (EV) far die Vergleichsgruppe (Abb. 4). Daraus folgt, dab die Osteoblasten unter dem EinfluB eines homogenen magnetischen Feldes urn 2,1% aktiver waren als diejen i g e n unter dem EinfluB eines heterogenen Feldes (p < 0,05, nicht signifikant).

Die Messung der optischen Dichte ergab im Durchschnitt 16,63 Belichtungswerte (EV) far die erste Gruppe und 16,54 Belichtungswerte (EV) far die zweite Gruppe (Abb. 5). Daraus folgt, dab die Osteoblasten unter dem Einflul3 eines in horizontaler Richtung homogenen magnetischen Feldes um 6,4 % aktiver waren als die Vergleichsgruppe (p < 0,05, nicht signifikant). Diskussion

Anhand der Ergebnisse kann festgestellt werden, dab statische magnetische Felder mit einer Intensit~it von 178 mT keinen signifikanten Einflug auf die Aktivit/it der Osteoblasten haben. Ahnlich wie in unserer Untersuchung fanden Gerber et al. [5] bei Organkulturen von Rattenoberschenkelknochen keinen Einflug magnetischer Felder bei einer Intensit~it von 30 Gaug (-'= 3 mT) auf das Zellwachstum in vitro. Zu ahnlichen Ergebnissen kamen audti-fgyformes et al. [4], die Gewebekulturen von JY-humanen Lymphozy~ ten, WI-18-humanen embryonalen Fibroblasten und LM-Fibroblasten yon Rattenembryonen untersucht haben. Vnukova [17] verwendete magnetische Fetder mit einer Stfirke von 1000 und 3000 Oesterdts bei Sfiugetierzelten und land keine signifikante Jimderung in

16,8~

Eu EV

Homogenes Feld

Heterogenes Feld

Homogenes Feld (vertikal)

Homogenes Feld (horizontal)

Abb. 4. Ergebnisse der Densitometrie ft~r die Abschnitte der Osteoblastenkulturen unter dem EinfluB eines homogenen (2 = 16,49 +_ 0,17) und eines heterogenen magnetischen Feldes (~ = 16,52 _+_ 0,13). EV = Belichtungswert (exposure value).

Abb. 5. Ergebnisse der Densitometrie fiar die Abschnitte der Osteoblastenkulturen unter dem EinfluB eines homogenen magnetischen Feldes in horizontaler (~ = 16,63 • 0,23) und in vertikaler Richtung = 16,54 + 0,16). EV = Belichtungswert (exposure value).

9 Urban & Vogel Fortschr. Kieferorthop. 53 (1992), 218-222 (Nr. 4)

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Papadopulos et aL : Einflufl magnetischer Felder auf Osteoblasten der Zellteilung und Zellmorphologie. Cerny [2] implantierte an H u n d e n im Bereich der Mundh6hle SmCO5 Magnete (lntensit~t: 95 roT) und fand nach sechs Monaten keine histologischen Ver~nderungen m den naheliegenden Gewebsregionen. Eine offene Frage ist die eventueUe Abh~ingigkeit der Osteoblastenreaktion v o n d e r Starke der Intensitfit der verwendeten statischen magnetischen Felder. In unserer Untersuchung haben wir Neodynium-Magnete verwendet, die eine maximale Intensit~it von 178 mT aufwiesen. Es ist nicht auszuschliegen, dal3 diese Intensit,it zu schwach war und daher eine Beeinflussung der Osteoblastenaktivit~it nicht erfolgte, denn Malinin et al. [12] stellten bei ihrer Zellkulturuntersuchung mit L929- trod WI-38-Zellen fest, dab durch starke magnetische Felder yon 5000 Oesterdts die morphologischen und physiologischen Transformationen der Zellen zunahmen. Andererseits fanden Tsoneva et al. [14], dab bei schwathen und kurzen magnetischen Feldern die Proliferation yon menschlichen Lymphozyten stimuliert, aber bei stgrkerer Intensit/it die Mitose und die blastische Zelltransformation verringert wurden.

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12. Bei der kritischen Beurteilung der Ergebnisse unserer als auch der der zitierten Untersuchungen ist jedoch zu beracksichtigen, dab Schlul3folgerungen yon In-vitroStudien nicht ohne weiteres auf die In-vivo-Verhfiltnisse fibertragen werden k6nnen.

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Schluflfolgerung Die vorliegenden Resultate zeigen, dal3 statische magnetische Felder mit einer Intensitfit von 178 mT keine signifikante Wirkung auf die alkalische Phosphataseproduktion und damit der Zellproliferation der Osteoblasten in vitro haben. Die bisherige Feststellung, dab die otethodontische Zahnbewegung mit Magneten schneller erfolgt [3, 6~ 7, 9. 10] k6nnte eher auf die Mechanik der verwendeten Magnetsysteme als auf eine erh6hte Osteoblastenaktivit~it zurtickgefahrt werden.

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Korrespondenzanschrift: Dr. Moschos A Papadopulos, Komninon Str. 90, Kalamaria, GR-551 32 Thessaloniki. 9 Urban & Vogel Fortschr:.Kteferorthop. 53 (1992), 218-222 (Nr. 4)