ARCH SOC ESP OFTALMOL. 2013;88(11):423–432

ARCHIVOS DE LA SOCIEDAD ESPAÑOLA DE OFTALMOLOGÍA www.elsevier.es/oftalmologia

Artículo original

Efectos corneales de hipotensores oculares que contienen cloruro de benzalconio: análisis in vivo con microscopia confocal H. Fernández Jiménez-Ortiz ∗ , N. Toledano Fernández, C.S. Fernández Escamez, S. Perucho Martinez y M.J. Crespo Carballés ˜ Servicio de Oftalmología, Hospital Universitario de Fuenlabrada, Madrid, Espana

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO

R E S U M E N

Historia del artículo:

Objetivo: Evaluar los efectos sobre la córnea humana de hipotensores oculares con cloruro

Recibido el 1 de agosto de 2012

de benzalconio (BAC).

Aceptado el 24 de abril de 2013

Métodos: Estudio prospectivo de cohortes, simple ciego realizado sobre 50 ojos de 50 pacien-

On-line el 8 de agosto de 2013

tes. Los criterios de inclusión fueron: diagnóstico reciente de glaucoma o hipertensión ocular sin tratamiento previo, terapia antiglaucomatosa prescrita por un oftalmólogo y con-

Palabras clave:

sentimiento para participar en el estudio. Los pacientes no fueron asignados al azar: el

Cloruro de benzalconio

oftalmólogo decidió la mejor terapia de acuerdo a los datos clínicos. Se dividieron en dos

Glaucoma

grupos: uno expuesto a BAC (23 pacientes) y otro no expuesto (27 pacientes). La media de

Córnea

seguimiento fue de 22 semanas (rango 18-30). Se midió el cambio en la densidad celular antes

Microscopia confocal

y después de la terapia en: el epitelio basal, la capa basal del epitelio limbal y el endotelio.

Estudios de cohortes

También se midió el cambio en la reflectividad estromal y el número de ramas del nervio del plexo subasal. La exposición a BAC era desconocida para el investigador principal. Resultados: Un mayor aumento en la densidad de la capa de células basales del epitelio se observó en la cohorte expuesta BAC (p < 0,05). No se detectaron diferencias significativas en la densidad del endotelio, las células del limbo, la reflectividad del estroma ni en el plexo nervioso subbasal. Edad, sexo, PIO, principio activo ni la concentración de BAC afectaron el sentido o la magnitud de las alteraciones encontradas en la superficie ocular. Conclusión: El tratamiento crónico antiglaucomatoso induce cambios en el epitelio corneal. Gotas sin conservantes mostraron una menor alteración de la superficie ocular por análisis de microscopia confocal. Los estudios futuros deben evaluar el impacto clínico de estos hallazgos histológicos. © 2012 Sociedad Española de Oftalmología. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.

∗

Autor para correspondencia. Correo electrónico: hector [email protected] (H. Fernández Jiménez-Ortiz).

0365-6691/$ – see front matter © 2012 Sociedad Española de Oftalmología. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.

http://dx.doi.org/10.1016/j.oftal.2013.04.013

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The effects of ocular hypotensive drugs on the cornea: An in vivo analysis with confocal microscopy a b s t r a c t Keywords:

Purpose: To evaluate the effects of anti-glaucoma treatments containing benzalconium chlo-

Benzalconium chloride

ride (BAC) on the human cornea.

Glaucoma

Methods: A prospective single masked cohort study was conducted on the 50 eyes of 50

Cornea

patients. The inclusion criteria were: recently diagnosed glaucoma or ocular hypertension

Confocal microscopy

with previous treatment, or ophthalmologist-prescribed anti-glaucoma therapy, and oral

Cohort studies

consent to participate in the study. The patients were not randomised, as the ophthalmologist decided the best therapy according to clinical criteria. The patients were divided in 2 cohorts: one exposed to BAC (23 patients), and not exposed (27patients). The mean followup period was 22 weeks (range 18-30). The change in cell density before and after therapy was measured in: basal layer epithelium, basal layer of limbal epithelium and endothelium. The change in stromal reflectivity and the number of nerve branches in sub-basal nerve plexus was also measured. BAC exposure was blinded to the main researcher. Results: A greater increase in basal layer epithelium cell density was observed in BAC exposed cohort (P < .05). No significant differences were detected in the endothelium, limbal cell density, stromal reflectivity, or sub-basal nerve plexus. Age, sex, IOP, active ingredient or BAC concentration did not affect the direction or magnitude of the ocular surface alterations found. Conclusion: Chronic anti-glaucoma therapy induces changes in the corneal epithelium. Preservative free drops showed less disruption of the ocular surface by confocal microscopy analysis. Further studies should be conducted to evaluate the clinical impact of these histological findings. © 2012 Sociedad Española de Oftalmología. Published by Elsevier España, S.L. All rights reserved.

Introducción El glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA) y la hipertensión ocular (HTO) son condiciones generalmente tratadas como primera elección con antiglaucomatosos tópicos con el fin de reducir el riesgo de pérdida progresiva de campo visual1 . Los análogos de prostaglandinas, inhibidores de la anhidrasa carbónica, ␣-agonistas y ß-bloqueantes son los más habituales2 . Todos ellos tienen efectos secundarios, tanto tópicos como sistémicos. Los fármacos de primera línea más comunes son los ß-bloqueantes y los análogos de las prostaglandinas. Los primeros (por ejemplo, timolol) se asocian a mayores efectos adversos sistémicos como bradicardia, fatiga, depresión, impotencia, etc.3,4 . Los análogos de las prostaglandinas han demostrado ser eficaces para reducir la presión intraocular (PIO), con escasa repercusión sistémica y con una posología que facilita el cumplimiento5 . Los análogos de las prostaglandinas (tafluprost, latanoprost, bimatoprost y travoprost) están actualmente disponibles como medicamentos tópicos antiglaucomatosos6 , y se recomiendan como tratamiento de primera línea para la reducción de la PIO en el GPAA y la HTO7 . Precisamente el mal cumplimiento es uno de los mayo˜ res obstáculos a la hora de frenar la progresión del dano glaucomatoso. Para promover el cumplimiento, los efectos adversos deben ser aminorados. Estos efectos adversos podrían ser atribuibles tanto al componente activo como a los conservantes, sin embargo se sabe que la frecuencia de ˜ los síntomas y de las senales objetivas de irritación de la

superficie ocular es menor cuando la terapia no contiene conservantes6,8 . El cloruro de benzalconio (BAC) es un conservante utilizado para mantener soluciones tópicas estériles, que ha demostrado tener efectos adversos sobre la córnea y la conjuntiva. El ˜ ocular BAC es capaz de inducir la toxicidad celular y el dano en una forma dosis-dependiente9 . Es un agente antimicrobiano que actúa desnaturalizando proteínas y alterando las membranas citoplásmicas hasta el punto de provocar citolisis. Esta propiedad se ha empleado también para facilitar la penetración de fármacos a través de los epitelios, es decir como vehículo de los antiglaucomatosos para penetrar en cámara anterior, desnaturalizando el epitelio corneal. El BAC se ha asociado con pérdida de células caliciformes10 , aumento de la deposición del colágeno subepitelial y con la infiltración en la sustancia propia de células inflamatorias11 . El BAC está presente en la mayoría de los tratamientos antiglaucomatosos tópicos comerciales. En la actualidad, solo hay unos pocos componentes activos BAC libres como el tafluprost (Saflutan® , MSD, Nueva Jersey, EE. UU.), el maleato de timolol ˜ y travoprost (Travatan (Timabak® , Thea, Barcelona, Espana) Z® , Alcon, Texas, EE. UU.). Tafluprost es una prostaglandina F2a-agonista sin ningún tipo de conservante. La microscopia confocal se describió por primera vez en 1940 por Goldman, pero se hizo clínicamente aplicable en los ˜ anos 80, con el desarrollo del láser en Oftalmología Clínica12 . La naturaleza no invasiva de la microscopia confocal proporciona un método para examinar la córnea en su estado fisiológico, evitando artefactos asociados con los estudios ex vivo. Esta técnica permite el examen longitudinal de la córnea

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en tiempo real12 . Además de proporcionar la información cualitativa, la microscopia confocal permite también el análisis cuantitativo de las poblaciones celulares, del plexo nervioso, etc.13 . Proporciona excelentes imágenes de los componentes celulares de la córnea y la conjuntiva, lo que permite un análisis cuasihistológico de la superficie ocular12,14 . El objetivo de este estudio es evaluar los efectos in vivo de fármacos que contienen BAC en la córnea humana, en el uso a largo plazo. Aunque hay gran cantidad de pruebas de la toxicidad del BAC sobre la superficie ocular in vitro, hay pocos estudios que evalúen sus efectos in vivo.

Material y métodos Estudio de cohortes prospectivo y simple ciego realizado sobre 50 ojos de 50 pacientes con GPAA o HTO. Los pacientes fueron reclutados en las consultas de Oftalmología General. Se solicitó a cada paciente consentimiento informado verbal para participar en el estudio. Los criterios de inclusión fueron: 1. Diagnóstico reciente de HTO, GPAA, glaucoma de ángulo cerrado (GAC), glaucoma normotensivo (GN), glaucoma en el síndrome de pseudoexfoliación o glaucoma en el síndrome de dispersión pigmentaria. 2. Sin tratamiento tópico previo para cualquier enfermedad ocular. Los criterios de exclusión fueron los siguientes: 1. Cirugía ocular, palpebral u orbitaria previas. 2. Trabeculoplastia láser o iridotomía previas. 3. Tratamiento sistémico con repercusión conocida sobre la secreción lagrimal o enfermedad autoinmune. 4. Usuarios de lentes de contactos actuales o en el pasado. 5. Evidencia en la anamnesis o en la biomicroscopia de trastornos de la superficie ocular: por ejemplo herpes zóster, cicatrices conjuntivales, etc. ˜ de la muestra se calculó utilizando el programa El tamano estadístico Epidat versión 4.0 (Sergas, Santiago de Compostela, ˜ El objetivo era detectar una diferencia de medias de Espana). al menos 15% en la densidad de la capa de células basales, basándonos en estudios similares6 . Considerando dos grupos ˜ y la igualdad de varianzas, se estimó necede igual tamano ˜ muestral de 42 individuos. Asumimos un sario un tamano 20% de pérdidas, por lo que se incluyeron 50 pacientes. El ojo seleccionado para el estudio (derecho o izquierdo) fue aleatorizado utilizando el programa SPSS versión 18.0 (SPSS, Chicago, Illinois, EE. UU.). El examen con lámpara de hendidura, la PIO y el análisis de microscopia confocal se llevaron a cabo antes de la introducción de la terapia. Los pacientes fueron divididos en 2 grupos según la exposición de BAC. Todos recibieron terapia única a lo largo del período de estudio: Cohorte 1: Incluye 25 ojos de 25 pacientes que recibieron terapias con BAC: latanoprost (Xalatan® , Pfizer, Nueva York, EE. UU.), travoprost (Travatan® , Alcon, Texas, EE. UU.) y bimatoprost 0,03% (0,03% Lumigan® , Allergan, California, EE. UU.). Todos los pacientes tenían enfermedad bilateral. Dos pacientes fueron excluidos debido a que no asistieron a la visita de seguimiento, por lo que 23 pacientes (23 ojos) completaron el estudio.

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Cohorte 2: Incluye 31 ojos de 31 pacientes que recibieron terapia sin BAC ni ningún otro conservante según la ficha técnica de los medicamentos: tafluprost (Saflutan® , MSD, Nueva Jersey, EE. UU.) y maleato de timolol 0,5% (Timabak® , Thea, ˜ Todos los pacientes tenían enfermedad Barcelona, Espana). bilateral. Cuatro pacientes fueron excluidos debido a que no asistieron al seguimiento, por lo que 27 pacientes (27 ojos) completaron el estudio. Todas las mediciones se realizaron por el mismo investigador (primer autor) que desconocía la terapia prescrita. Los pacientes sí la conocían, por lo que el estudio fue simple ciego. Se midió la PIO con tonómetro de aplanación de Goldmann. La microscopia confocal se realizó con láser digital de barrido microscópico (HRT II, Módulo de Córnea Rostock, Heidelberg Engineering GmbH, Heidelberg, Alemania). El dispositivo emplea láser diodo de color rojo, de helio-neon a una longitud de onda de 670 nm. La captura de imágenes es en cuadrados de 0,4 x 0,4 mm, cada sección tiene un espesor de 4 ␮. Se aplicó anestesia tópica con oxibuprocaína 4 mg/ml 1 mg/ml y tetracaína (Anestésico doble® , Alcon Cusí SA, Bar˜ se administró en el fondo de saco conjuntival celona, Espana) inferior, antes del examen. La lente del dispositivo se sumergió completamente en Methocel 2% (OmniVision® , Pucheim, Alemania). Se tomaron al menos 20 imágenes de cada capa estudiada con el dispositivo sobre la córnea central. Se estudiaron las capas en el siguiente orden: capa basal del epitelio corneal, plexo nervioso subbasal, estroma y endotelio. Posteriormente, se solicitó al sujeto que mirara lateralmente con el fin de exponer la conjuntival limbar temporal (debido a la mayor facilidad en la toma de imágenes que en el lado nasal) para capturar 20 imágenes de la capa basal del epitelio conjuntival limbar. El procedimiento duró 4-5 min para cada ojo. Se aplicó una gota ˜ al de Tobramicina (Tobrex® , Alcon Cusí SA, Barcelona, Espana) final de cada examen para evitar infecciones secundarias a la manipulación. Las imágenes mejor enfocadas y más representativas de cada nivel histológico se seleccionaron para el análisis estadístico. La densidad celular se obtiene con un software incluido ˜ área de cada imaen el dispositivo: se selecciona una pequena gen y se cuentan manualmente las células o ramificaciones neuronales. Posteriormente, el software extrapola los datos ˜ área a toda la córnea. La unidad obtenidos en esa pequena de medida fue células por milímetro cuadrado (cel/mm2 ). El protocolo de recogida de datos fue: 1. Densidad celular en el epitelio basal (fig. 1): Se enfocó la imagen 10 ␮ por encima de la membrana de Bowman. La superficie total mínima examinada fue 0,021 mm2 y un mínimo de 80 células fueron contadas manualmente. Las células solo parcialmente contenidas en el área no fueron contadas. Si el área mínima no estaba disponible, la medición se consideró perdida. 2. Reflectividad de queratocitos del estroma (fig. 2): Se enfocó la imagen 20 ␮ bajo la capa de Bowman. Para mejorar la reproducibilidad de nuestro estudio adoptamos la gradación propuesta por Martone6 (fig. 1). Por lo tanto, se clasificó a cada paciente de acuerdo a 4 grados posibles de reflectividad estromal. Al menos 3 imágenes enfocadas en estroma fueron estudiadas en cada paciente.

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Figura 1 – Capa basal del epitelio corneal. El examen inicial (imágenes superiores) correspondiente a 2 pacientes distintos. ˜ homogéneo. El fondo es más brillante que en el epitelio conjuntival. Las células son irregulares, bien definidas y de tamano ˜ que El examen de seguimiento (imágenes inferiores) de los mismos pacientes. Las células son ligeramente más pequenas en las capturas iniciales.

3. Número de ramificaciones nerviosas subbasales (fig. 3): Para intentar mejorar la reproducibilidad se definió este parámetro como la suma de las ramas nerviosas presentes en una imagen, al igual que en el estudio de Martone6 . Se analizó la imagen del plexo subbasal con el mayor número de fibras nerviosas reconocibles. 4. Densidad celular en la capa basal limbar conjuntival (fig. 4): La superficie total mínima examinada fue 0,021 mm2 y un mínimo de 80 células fueron contadas manualmente. Las células solo parcialmente contenidas en el área analizada no fueron contadas. Si el área mínima no estaba disponible, la medición se considera perdida. 5. Densidad celular en el endotelio (fig. 5): Se consideró solo si las células hexagonales características se observaban con buena calidad. La superficie total mínima examinada fue 0,021 mm2 y un mínimo de 50 células fueron contadas manualmente. Las células solo parcialmente contenidas en el área analizada no fueron contadas. Si el área mínima no estaba disponible, la medición se consideró perdida.

Se realizó el análisis estadístico de la diferencia entre los valores antes y después del tratamiento. Así, se compara la variación en la densidad celular, la reflectividad estromal o el número de nervios en plexo subasal a lo largo del período de tratamiento. El análisis estadístico se realizó mediante el programa SPSS versión 18.0 (SPSS, Chicago, Illinois, EE. UU.). La distribución normal de las variables se determinó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Las variables cuantitativas se expresaron como media, desviación estándar y el intervalo de confianza. Las medias se compararon mediante la prueba t de Student para muestras independientes. Para estudiar las asociaciones entre las variables cuantitativas, se empleó la prueba de correlación de Spearman. Los valores de p < 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos.

Resultados Las características demográficas y los datos clínicos fueron similares en ambas cohortes (tabla 1). La distribución por

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Figura 2 – Reflectividad estromal clasificada en 4 grados. A) Grado 1 (Arriba a la izquierda): núcleos de queratocitos normales se ven como objetos brillantes sobre un fondo oscuro. La relación de queratocitos activados/no activados