Krause, Beyer: Reinheit handelsüblicher Insulinzubereitungen

Deutsche Medizinische Wocheuschrift

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2.38

Dtsch. med. Wschr. loo (1975), 238-240 © Georg Thieme Verlag, Stuttgart

Die Reinheit handelsüblicher Insulinzubereitungen

The purity of commercial insulin preparations

U. Krause und J. Beyer

Ingulin preparations available in Germany were tested by poiyacrylamide-disc electrophoresis. A large proportion of preparations contained proteins additional to insulin. Insulin purified chromatographically was cleaner than that by crystallization. Insulin purified by ion-exchange chromatography had the highest degree of purity: in addition to the insulin band only deamidation products of insulin were demonstrated. Deamidation occurs both in neutral and acid solvents. These observations indicate that commercial full purification of insulin is possible but not always practised.

Abteilung für Klinische Endokrinologie der Il. Medizinischen Klinik und Poliklinik (Leiter: Prof. Dr. J. Beyer) der Universität Mainz

Auf dem deutschen Markt befindliche Insulinzubereitungen wurden mit Hilfe der Polyacrylamid-Disc-Elektrophorese untersucht. Ein großer Teil der untersuchten Insulinzubereitungen enthielt neben Insulin noch andere Begleitproteine. Chromatographisch gereinigte Insuline waren sauberer als nur durch Kristallisation gereinigte Insuline. Durch lonenaustauschchromatographie gereinigte Insuline zeigten den höchsten Reinheitsgrad; außer der Insulinbande waren nur noch Desamidierungsprodukte von Insulin nachweisbar. Die Desamidierung tritt im neutralen wie im sauren Lösungsmittel auf. Unsere Untersuchungen zeigen, daß die fabrikmäßige Reindarstellung von Insulin möglich ist, jedoch nicht immer praktiziert wurde.

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Febniar 1575,

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Krause, Brycr Reinheit handdsiiblicher Insulinzuberrirungtn

lOO. Jg.

Aus der Literatur ist bekannt, daß handelsiibliche Insu-

linzubereitungen neben Insulin in wechselnder Konzentration Begleitproteine enthalten (6, 7). Schlichtkrull und Mitarbeiter (5) konnten zeigen, daß für die Antigenität nicht das Insulinmolekül selbst, sondern hochmolekulare Begleitproteine ausschlaggebend sind, die in handelsüblichen Insulinzubereitungen gefunden werden. Selbst mehrfache Kristallisationen von Insulin führen nicht zu einer Reinheit, wie man sie üblicherweise von Arzneimitteln fordert. Aus diesen Gründen gingen inzwischen einige Hersteller dazu über, nach verschiedenen Verfahren weitergereinigte Insulinzubereitungen in den Handel zu bringen. Die ersten klinischen Erfahrungen mit diesen hochgereinigten Insulinen (2, 3) zeigen, daß dic Antigenität speziell gereinigter Insuline bedeutend niedriger zu sein scheint als die nach früheren Herstellungsarten. Von Interesse war in diesem Zusammenhang für uns weniger die klinische Bedeutung der Insulinreinigung als die Frage, ob die neuen Insuline hinsicht(ich ihres Reinheitsgrades dem Standard moderner Arzneimittel entsprechen. Aus diesem Grunde wurden alle in Deutschland befindlichen Insulinzubereitungen elektrophoretisch untersucht. Zusätzlich wurden einige noch nicht im Handel befindliche, von den Herstellerfirmen als besonders rein empfohlene Insulinchargen elektrophoretisch aufgetrennt.

Material und Methoden Unser Untersuchungsmaterial bestand aus jeweils den neuesten Chargen handelsüblicher Insulinzuhereitungen. Von der Firma Hornnionchemie und den Farbwerken Hoechst wurden au6erdem noch nicht im Handel befindliche Versuchspräparare elektrophoretisch untersucht. Jeweils 10 il der Insuliniösung wurden elektrophoretisch aufgetrennt. Alle verwandten Chemikalien waren von analytischer Reinheit. Acrylamid wurde zusätzlich vor Gebrauch aus Chloroform umkrisrallisiert. Als Elekrrophoresesysteni wurde das von Davis (1) und Ornsicin (4) beschriebene System verwendet.

Ober einem IS%igen Trenn-Gel (pH 8,9) wurde ein 2,5 %iges Sammel-Gel (pH 6,7) polymerisiert. Das Substanz-Gel bestand aus einem Aliquot einer Insulinlüsung entsprechend dem jeweiligen Ampulleniiihalt und S Teilen Samrnel-Gel-Lösung. Als Elektrophoresepuffer diente ein Tris-Glycin-Puffer mit einem pi-I von 8,3. Die Stromstärke betrug bis zum Eintreten der Pufferfront in das TreninGel 1 bis 2 mA/Gel und wurde danach auf 4 mA/Gel erhöht. Nach Beendigung der Elektrophorese wurden die Gek mit Wasserdruck aus den Röhrchen entfernt und mit Anazolen-Natrium (Coomassie Blue) gefärbt. Die Dokumentation der Elektrophnresen erfolgte durch Photographie unter Verwendung eines Rotfilters im Durch-. licht. Ein quantitativer Vergleich der Verunreinigungen untereinander in den Insiilinzuhereitungen ist wegen der nicht proportionalen Anfärbung der Proteine nicht möglich.

Ergebnisse Die Abbildungen 1 und 2 zeigen die Elektrophoresen von Handelsinsulinen, die aus teilweise mehrfach um: kristallisierten, edoch nicht weiter gerei nigten Insu1 men hergestellt wurden. Deutlich erkennbar sind die teilweise starken Beimengungen höhermolekularer Begleirproteme. Eine Ausnahme bilden lediglich die Insuline der Firma Brunnengräber, die sich als relativ einheitliche Proteinfraktionen darstellen. Diese Beobachtungen wurden bereits von Tjioc und Wacker (6) mitgeteilt. Beim Hg-Insulin der Firma Hoechst sind noch weitere Banden erkennbar, die vom Humanglobulinzusatz stammen. Abbildung 3 zeigt Insulinzubereitungen, bei denen durch Gelchromatographie gereinigtes Kristallinsulin verwandt wurde. Die hochmolekularen Beimengungen werden bei diesem Verfahren weitestgehend entfernt. Niedermolekulare Beimengungen, wie das Argin inInsulin und die Desamido-Insuline, können auf diese Weise nicht entfernt werden. Abbildung 4 zeigt die Elektrophoresen von Handelsinsulinen, die über Ionenaustauschchromatographie gereinigt worden sind. Dieses Verfahren gestattet die Entfernung von allen, also auch den niedermolckularen

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Abb.

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Kristallisation 'gereinigte< Handelsinsuline.

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Abb. 2. Durch Kristallisation gereinigre Handelsinsuline.

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Nr. 6,

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Deutsche Medizinische Wochenschriít

Krause, Beyer: Reinheit handelsüblicher Insulinzubereitungen

Arginin

-

Insu1

Insulin

in Monodesumido-lnsul in

Insulin

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- Insuline

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MC - Insulin Novo-Semilerite CS

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Hoechst

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Insulin

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Hoechst

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Abb. 4. Durch Ionenaustausch-Chromatographie gereinigte Handelsinsuline.

CS-Depot-Insulin-S Hoechst

CS-Hg-Insulin-S Hoechst

Sonderfertigung-Horm fformonchemie Insulin Leo Sonderfertigung

Abb. 3. Durch Gel-Chromatographie gereinigte Handelsinsuline.

rung spontan desamidieren soll und Desamido-Insulin selbst keine größere Antigenität als Insulin aufweist. Die Desamidierung findet nicht nur bei den im sauren pH gelösten Handelsinsulinen, sondern auch bei neutralem pH statt (Abbildung 4). Allerdings läßt sich bei der Ionenaustauschchromatographie zur Herstellung der gereinigten Insulinpräparationen eine Trennung von Insulin und dessen Desamidierungsprodukten nicht vermeiden. Durch die Wahl der geeigneten Extraktionbedingungen sollte daher die Desamidierung bei der Extraktion vermieden werden.

Beimengungen. Dieses Verfahren soll allerdings mit einem beträchtlichen Substanzverlust behaftet sein.

Literatur

Diskussion

Sci. 121 (1964), 404.

Unsere Untersuchungen zeigen, daß ein großer Teil der auf dem deutschen Markt befindlichen Insulinpräparate nicht die Reinheit aufweist, die üblicherweise von anderen Arzneimitteln gefordert wird. Am Beispiel der chromatographisch gereinigten Insuline kann gezeigt werden, daß die fabrikmäßige Reindarstellung von Insulin möglich ist. Ob bei der Reinigung die Entfernung aller niedermolekularen Substanzen notwendig ist, mögen klinische Untersuchungen zeigen. Im Falle der Desamido-Insuline erscheint uns diese Entfernung nicht sinnvoll, da Insulin bei längerer Lage-

Davis, B. J.: Disc-electrophoresis. Il. Method and application for human serum proteins. Ann. N. Y. Acad.

Fankhauser, S., I. Michl: Neue Aspekte der Insulintherapie. Mono-

komponent.lnsuline. 3. Internationales Donausymposion über Diabetes mellitus, Salzburg 1973. Korp, W., R. E. Levett: Erfahrungen mit Monokomponenten.lnsulin. Wien. kim. Wschr. 85 (1973), 326. Ornstein, L.: Disc-electrophoresis. Background and theory. Ann. N. Y. Acad. Sci. 121 (1964), 321.

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0. Haliund, L.

Dr. U. Krause, Prof. Dr. J. Beyer Abteilung für klinische Endokrinologie II. Medizinische Klinik und Poliklinik der Universität 65 Mainz, Langenbeckstr. 1

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Hoechst