Planta (Berl.) 79, 146--161 (1968)

Zur Rolle yon Plastocyanin und Cytochrom f im photosynthetischen Elektronentransport* E. ELST~E~, E . PISTORTUS, P. B S G ~ R * * u n d A. TX~nBST Pflanzenphysiologisches Institut der Universit/~t GOttingen, Abt. Biochemie der Pflanzen Eingegangen am 4. November 1967

The Role o/ Plastocyanin and Cytoehrome / in Photosynthetic Electron Transport Summary. The dependence of photosynthetic NADP reduction on plastocyanin in three different fragmented systems from spinach chloroplasts was investigated. 1. In sonicated chloroplasts oxygen evolution and NADP reduction is restored by the addition of 3 m~moles of plastocyanin obtained from spinach. Thirty m~zmoles of cytochrom%52 from Euglena replaces plastocyanin at pH 7.4 to about 75% and at pH 8.0 to only about 30%. NADP reduction at the expense of an artificial donor system by the same sonicated chloroplast preparation is, however, restored by plastocyanin and cytochrom%52 equally well. 2. It is already well documented that in digitonin fragmented chloroplasts N A D P reduction at the expense of an artificial donor system is stimulated by the addition of plastocyanin. Cytochrome552 from Euglena is as effective as plastocyanin in this system. 3. Heptane treatment of chloroplasts followed by water extraction also leads to the liberation of plastocyanin. N A D P reduction in heptane treated chloroplasts at the expense of an artificial donor system is stimulated either by the addition of plastocyanin or of cytochrom%52. These results show that in three different types of particles from spinach chloroplasts both plastocyanin (spinach) and cytochrome55 ~ (Euglena) are equally effective als electron donors for pigment system I of photosynthesis, coupled to N A D P reduction. This conclusion follows from the fact that both are equally effective in stimulating NADP reduction at the expense of an artificial electron donor system. In sonicated chloroplasts plastocyanin seems to be the better electron acceptor for electrons coming from the photooxidation of water by light reaction II, since addition of plastocyanin to a system depending on oxygen evolution yields better rates than addition of cytochrom%5.~. In order to explain the result that there are two possible electron donors for pigment system I it is suggested that there are two - - perhaps spatially separated - pigment systems I in photosynthesis which are participating in a non-cyclic or a cyclic electron transport system and which are either coupled to plastocyanin or to cytochrome f. The difference in rates mentioned above may indicate that plastocyanin is a component of non-cyclic and cytochrome f of cyclic electron flow. The cyclic system can be converted into a non-cyclic system by the addition of an artificial electron donor and NADP. * Herrn Prof. Dr. R. HAgD~g zum 80. Geburtstag gewidmet. ** Botanisches Institut der Universit~tt K61n.

Plastocyanin und Cytoehrom fim Elektronentransport

147

Einleitung Das 1952 yon DAVENPORT und HILL entdeckte Cytochrom f u n d die cntsprechendcn Cytochrome des f-Typs aus Algen [z. B. Cytochrom55a aus Porphyra (KATOII,1960 a), Cytochroma5~ aus Euglena (PERINIet al., 1964), Cytochrom55a aus B]aualgen (SvsoR nnd KI~OOMANN, 1966; HOLTON und MY]~Rs, 1963 und 1967)] werden bisher als unmittelbare Elektronendonatoren ffir das Pigmentsys~em I des photosynthetischen Elektronentransportes angesehen. Die Vorstcllung fiber die Funktion diescr Cytochrome beruht auf zah]reichen spcktroskopischen Versuchcn. DuYsENs und andere Autoren zeigten, dag Cytochrome dnrch Licht yon Wellcnlangen gr6ger als 700 m~ photooxydicrt, durch Licht kiirzercr Wellenlangen photorcduziert werden (s. IJbersicht y o n D U Y S E N S , 1964). Auf diescs Verhalten dcr Cytoehrome vom f-Typ stiitzt sich die heutige Dcutung des Emcrson-Effektes dutch zwei in Serie gesehaltete Liehtreaktionen, die dutch eine Elektronentransportkctte mit Cytochrom f, Plastochinon und anderen Redoxcarricrn miteinander verbunden sind. In diese Kette einzuordnen ist auch das dutch KATO• (1960b; KA~O~ und TAKa~IYA, 1961) cntdccktc Plastocyanin, das das gleiehe Redoxpotential wie Cytochrom f hat und ebenfalls ubiquitar in Pflanzen und Algcn verbrcitet ist. Biochemisehe Versuche mit fragmcnticrten, plastocyaninfreien Chloroplasten zeigten, dag Plastocyanin flit die photosynthetische NADPgeduktion dutch Pigmentsystem I notwendig ist (KaTOH und TAKAMIYA, 1963a und b ; TRE]3STnnd ELsTN~, 1965 und 1967 ; W]~ss~Ls, 1966). An der Rolle des Cytochroms f als nnmittelbarem Donor ffir das Pigmentsystem I wurde zunachst nieht gezweifelt, und Plastocyanin wnrdc deshalb vor dem Cytochrom f in die Elektronentransportkettc cingeordnet (T~E]3ST und PISTO~IUS, 1965; FoR~ und Ul~BACH, 1965). Die Versuche yon Ko~: ctal. (1964), KoK und RU~aXNSKI (1965) ergaben, dab P~00(das Pigment yon Lichtrcaktion I) sowohl Plastocyanin als auch Cytochrom f unmittelbar zu oxydieren vcrmag; demzufolge mfiBten Plastoeyanin und Cytoehrom f parallel in die K e t t e cingeordnet werden. Versuche yon GORMAN und L]~WNE (1965 und 1966) mit Mutanten yon Chlamydomonas schienen darauf hinzudcuten, dag Plastocyanin nach dem Cytochrom f in dcr Kctte steht. Damit lagen also sich v611ig widcrsprcchende Ergebnisse zugunsten aller drei m6gliehen Plaeicrungen der zwei l~edoxcarricr zueinander vor. Wit m6chtcn bier fiber den Vergleich yon Cytochrom55~ aus Euglena und Plastocyanin aus Spinat in dcr photosynthctischen NADP-Reduktion in vcrschiedenen Systemcn ans fragmentierten Chloroplasten berichten, die zugunsten eincr parallelen Anordnung sprechen.

Folgende Abl~i~rzungen werden verwendet: DAD = Diaminodurol; DCMU = Dichlorphenyldimethylharnstoff; DCPIP ~ Dichlorphenolindophenol; N A D P ~ Nicotinamid-Adenin-Dinuc]eogid-phosphat; TMPD = N-Tetramethyl-p-phenylendiamin. 11 Planta (Berl.), Bd. 79

148

E. ELSTNER, ]~. PISTORIUS,P, B6G~ und A. T~BsT:

Ergebnisse KA~o~ und TAKAMIYA (1965) und KATOH und SA~ PIET~O (1966) haben gezeigt, dal~ bei Ultraschall-Behandlung yon Chloroplasten Plastocyanin ffeigesetzt wird. In diesen Partikeln aus Chloroplasten liel3 sich die NADP-Reduktion mit DCPIP/Aseorbat als Elektronendonator durch Zugabe yon Plastocyanin reaktivieren. Aul]erdem wurde auch die NADPBildung ohne Donorsystem durch Plastocy~nin stimuliert, so dab vermutlich auch die Liehtreaktion I I wieder an Lichtreaktion I angekoppelt werden konnte. In diesem System haben wir untersucht, ob sich das Ptastocy~nin dutch Cytochrom552 aus Euglena ersetzen 1/~$t. Tabelle 1. Stimulierung der O~-Entwicklung in Hill.Reaktionen mit K-Ferricyanid bzw. mit NADP dutch Plastocyanin bzw. Cytochrom~52 in Ultraschall.behandetten Chloroplasten (18 rain Licht bei pH 7,4 bzw. 30 rain Licht bel pH 8,0 in N2)

pH = 7,4 ~Atome 0 entwiekelt

pH = 8,0 ~lVfol NADPH~ gebildet

Ferricyanid 4,8 + 3,0 mfdVlolPlastocyanin 6,6 -}- 25,0 m~zMolCytochrom552 NADP 1,5 + 1,5 m~Mol Plastocyanin 4,6 + 3,0 mtxMolPlastocyanin + 25,0 m~Mol Cytochroms5~ 3,8 + 50,0 m~Mol Cytochrom55~

~Atome 0 entwickelt

~Mol NADPH~ gebfldet

3,3 3,9 3,3 1,6 4,7 4,0

1,6 3,0 2,9 1,9 1,9

1,5 2,8 3,1 2,2 2,1

Wie die Versuche in Tabelle 1 und in Abb. 1 zeigen, kann die 02-Entwicklung und die NADP-Reduktion in Ultrasehall-behandelten Chloroplasten dureh Plastoeyaninzugabe stimuliert werden. Etwa 2,0 m~Mol Plastoeyanin s/~ttigen die Reaktion. In Ubereinstimmung mit KATO~ und SA~ PI~,TRO (1966) sind die Raten der NADP-Reduktion und O~Entwicklung bei p H 7,4 grSBer als bei pH 8,0. Der Grund ist wahrscheinlich darin zu sehen, dab bei der Ultraschall-Behand]ung die ATPBfldung entkoppelt wird, so dab das pH-Optimum der NADP-Reduktion yon dem des ATP-Bfldungssystems auf das des E]ektronentransportsystems sinkt. Wahrend P]astocyanin sowohl bei pH 7,4 wie bei p H 8,0 die O~-Entwicklung in der NADP-Reduktion stimuliert, ist Cytochroms5~ aus Euglena bei pH 8,0 weniger ~ r k s a m und ersetzt Plastoeyanin zu etwa 30 %. Bei p H 7,4 erreichen s/~ttigende Mengen Cytochrom552 etwa 75% der Stimulierung durch das Plastoeyanin. Die Sattigungskonzen-

Plastocyanin und Cytochrom fim Elektronentransport

149

trationen fiir Cytochroms~ ~ sind etwa um den Faktor 10 hSher als die ffir Plastocyanin (Tabelle 1). Die H i l l - R e a k t i o n mit K-Ferricyanid als Aceeptor wird durch Zugabe yon Plastocyanin wesentlich weniger stimuliert (Tabelle 1) und das pitOptimum liegt, wie bereits KATOg und SA~ PIETRO (1966) und JAco]~I (1967) zeigten, unter p H 7,0. Dies deutet darauf hin, dab K-Ferricyanid unmittelbar durch Lichtreaktion II reduziert wird und deshalb Plastocyanimunabhi~ngig ist. Auch die H i l l - R e a k t i o n mit Anthrachinon (gemessen unter Luft als pseudocyc]ische Reaktion unter Autoxydation des 5.0 u

,~ d \ ~

"~ 4,0

~

c o

o 3.0 ~D

oE 2.0

~

2

I

p

r

i

r

r

~

4.

6

8

10

12

14.

16

,

18 rain

Abb. 1. Stimulierung der O=-Entwicklung durch 1,5 m~Mol Plastocyanin bzw. 25 m~zMolCytochrom55=in einer Hill-Reaktion mit NADP in Ultraschall-behandelten Chloroplasten (N=, pH 7,4) gebildeten Anthrahydrochinons) wird durch Plastocyanin und Cytoe h r o m ~ stimuliert (Tabe]le 2). Die Raten des Systems sind allerdings geringer als die der NADP-Reduktion. Ws nach diesen Ergebnissen die Ankopplung der Lichtreaktion I I mit der 02-Entwieklung an die NADP-Reduktion durch Plastoeyanin Tabelle2. Stimulierung der photosynthetischen Anthrachinonreduktion (gemessen als O~-Au/nahme der Autoxydation des gebildeten Anthrahydrochinons) mit und ohne Donorsystem durch Plastocyanin bzw. Cytochrom~5~ in UltraschaU-behandelten Chloroplasten (30 rain •icht im Versuch ohne und 20 rain Licht im Versuch mit 0,2 l~Mol DAD + 10 ttMol Ascorbat in Lu/t, pH 8,0) ~Atome 0 aufgenommen ohne

mit DAD/Ascorbat und 2.10 -5 m DCMU

0,1 FMol AnthrachinonsulfonsEure + 2,0 mFMol Plastocyanin

0,7 1,8

2,9 14,1

+ 25,0 m~Mol Cytochrom55~

1,7

15,3

11"

150

E. ELSTNER,E. P~STORIUS,P. BSGERund A. TREBST:

Tabelle 3. Stimulierung der photosynthetischen NADP-Reduktion au] Kosten yon DAD-Ascorbat dutch Plastocyanin bzw. Cytochrom55~ in Ultraschall-behandelten Chloroplasten (18 rain Licht bei pH 7,4 und 30 rain Licht bei pH 8,0 in N2)

2.10 -5 m DCMU, 0,2 ~Mol DAD und 10 tzMolAscorbat

-

~Mol NADPH2 gebildet bei pH

-

~- 1,5 mgMol Plastocyanin ~- 3,0 m~Mol Plastocyanin ~- 25,0 mgMol Cytochrom552 -~ 50,0 m[~Mol Cytochroms52

=

7,4

1,2 3,2 3,5

bei pH

=

8,0

1,1 4,0 4,2 3,7 4,2

Tabelle 4. Abh~ingigkeit der photosynthetischen NADP-Reduktion in Ultraschallbehandelten Chloroplasten yon Plastocyanin und Elelctrondonor (15 rain Licht in N2, 2.10 -5 m DCMU in ]edem Ge/gfl)

Zusatz zu 10 y2VIolAscorbat

~- 0,2 ~Mol DCPIP ~- 0,2 ~Mol TMPD ~- 0,2 ~Mol DAD ~- 0,2 ~Mol DAD + 0,033% Triton

~Mol NADPI-I~ gebildet bei pH 7,4

bei pH 8,0

ohne

mit 2 m~Mol Plastocyanin

ohne

mit 2 m[zMol P]astocyanin

0,1 1,7 0,5 0,9 0,2

0,8 4,1 1,2 2,6 3,2

0,1 1,8 0,6 1,0 0,1

1,4 3,8 1,3 2,9 3,5

besser gelingt als durch Cytochrom55~, ist die photosynthetische NADPReduktion auf Kosten des k/instlichen Elektronendonatorsystems DAD/ Aseorbat sowohl bei pH 7,4 wie bei p H 8,0 dureh Plastocyanin und Cytoehrom~5 ~ gleieh gut stimulierbar (Tabelle 3). 2 miEVIol Plastocyanin bzw. 25 ~Mol Cytoehrom552 si~ttigen das System, denn eine ErhShung der Konzentration fiihrt kaum zu einer grS~eren Stimulierung. Als Elektronendonatorsystem fiir das NADP-System kSnnen DCPIP, DAD und TMPD verwendet werden (Tabelle 4). Die Plastoeyanin-Stimulierung ist im TMPD-System am geringsten und nur wenig - - wenn fiberhaupt - hSher als mit Aseorbat allein. Das DCPIP-System reduziert aueh ohne Plastocyanin-Zusatz ~qADP, d.h. es kann Plastoeyanin teflweise ersetzen. Der Zusatz kleiner Mengen Triton X 100 stimuliert das DAD-System und setzt den Nullwert ohne Plastocyanin herab (Tabelle 4). Aueh die Anthraehinonreduktion (wieder fiber die O~-Aufnahme bei Autoxydation des Anthrahydrochinons gemessen) wird in einem Elektronendonator-

Plastocyanin und Cytochrem f im Elektronentransport

151

system durch Plastocyanin und Cytoehrom552 in gleichem Mal3e stimuliert (Tabelle 2). Eine Digitonin-Fragmentierung yon Chloroplasten wurde yon NIEMA~ und V ~ S L A ~ D (1959) eingeffihrt und ffihrt, wie ~]~ATOHund TA~;A~YA (1963 a nnd b) zeigten, zur Freisetzung yon Plastoeyanin. Digitoninfragmentierte Chloroplasten sind ein gntes enzymatisches Testsystem ftir Plastocyanin, weft die NADP-l~eduktion (die in diesem System nur auf Kosten eines kiinstlichen Elektronendonatorsystems m6glich ist) plastocyanin-abh/~ngig ist (KA~oJ~ und TAKA~YA, 1963a und b; T~BST und ELST~Sa, 1965 und 1967; W~ss~s, 1966). KoK et al. (1964) zeigten, dab Digitonin-fragmentierte Chloroplasten sowohl Plastocyanin aus Spinat wie Cytochrom5s ~ aus Euglena photooxydieren k6nnen. Wie Tabelle 5 Tabelle 5. Stimulierung der photosynthetischen NADP-Redulction durch Plastocyanin und Cytochrom~52 in Digitonin-/ragmentierten Chloroplasten mit verschiedenen Elektronendonatoren (15 rain Licht in 2V2, lO #Mol Ascorbat, 0,2 #Mol Donor, 6 ttMol N A D P und Zusatz yon Ferredoxin-NADP-Reduktase, pH 8,0) V.MolNADPH2 gebilde$

DAD/Ascorbat TMPD/Ascorbat DCP[P/Ascorbat

Ohne Zusatz

mit 3 m~Mol mi~ 30 m~Mol Plas~ocyanin Cytochrom55~

0,4 0,25 1,3

4,0 1,5 4,3

3,4 1,1 3,9

zeigt, ist mit Cytochrom55~ aus Euglena eine nuhezu ebenso gute Stimulierung der NADP-Reduktion wie mit Plastocyanin zu erreichen. Wie schon frfiher gefunden wurde (T~EBST und ELST~EI~, 1965 und 1967), hat das DCPIP-System auch ohne Pl~stoeyanin- oder Cytoehrom55~-Zusatz geringe Aktivit~t; die Aktivits im TMPD-System ist auch nach Zusatz yon Plastocyanin deutlich geringer. Die ersten Versuche zur Photoreduktion yon NADP mit diesem System bei Zusatz yon Cytochrom f aus Spinat oder Petersilie ergaben, dub Plastocyanin nicht durch Cytochrom f ersetzt werden kann (WEsS]~LS, 1966). Entweder fiihren die derzeitigen Methoden zur Isolierung von Cytochrom f aus hSheren Pflanzen nicht zu einem aktiven Protein, oder das Cytochrom552 aus Euglena entsprieht nicht dem Cytoehrom f. HE~INGEI~ und CRA~S (1967) berichteten kfirzlich fiber einen neuen Redoxearrier, l~ubimedin, der dnrch wal~rige Extraktion nach einer Heptan-Behandlung aus den Chloroplasten entfernt wird. In ihren Versuehen reaktivierte die Zugabe yon l~ubimedin nnd einer Lipidfraktion die photosynthetisehe Aktiviti~t in einer NADP-Reduktion in diesen Heptan-extrahierten Partikeln. Wie die Versuche der Tabelle 6 zeigen,

152

E. ELSTNV.R,E. Pzs~om-~s, P. BSG~ und A. TRE~ST:

in Heptan-behandelten Chloroplasten Tabelle 6. Stimulierung der 2r dutch Plastocyanln bzw. Cytochrom~5~ (15 rain Licht in 2V~,pH 8,0) FI~ol NADPH~ gebildet 4- 3 m~Mol Plastocyanin --

4- 30 mFMol Cytochrom552

0,1

+ Ascorbat + DAD/Ascorbat 4- TMPD/Ascorbat

4- DCPIP/Ascorb~t

1,0 0,85 1,8

1,1 4,5 3,i 4,1

4,3 3,3 5,4

4.8-

~

4,0

~3.2 123 7 2A :a. 16 08~J o / I

I I

I

0.9

1.53.0 6.0

I

[

f

1.8 2.'7 3.6 m#JVlol Plastocyanin ]z.o 180 24.0 m~aMOI Cytochroms52

I

4.5 30.0

Abb. 2. Abh~ngigkeit der NADP-Reduktion in Heptan-behandelten Chloroplasten yon der Konzentration an Plastocyanin bzw. Cytochrom~2 (15 min Licht in N2; 0,2 FMol TMPD und 10 FMol Ascorbat pro Gef~B) wird bei dieser Heptan-Behandlung auch Plastoeyanin aus den Chloroplasten entfernt (wir halten diese Methode ffir die einfachste und schnellste, um aus Chloroplasten reines Plastocyanin zu erhalten). I n den mi~ der Lipidffaktion versetzten Partikeln (tier H e p t a n e x t r a k t wird wieder auf die Chloroplasten aufgedampft) naeh Heptan-Behandlung yon Chloroplasten l~Bt sieh die NADP-Reduktion (auf Kosten eines Elektronendonatorsystems) dureh Zugabe yon Plastocyanin oder Cytoehrom552 reaktivieren. Abb. 2 zeigt, dab bei Zugabe yon 3 mFMol Plastocyanin oder 30 m~Mol Cytochrom552 gleiche R a t e n der l~ADP-Reduktion erreicht werden, also eine 10mal hShere Konzentration yon Cytochrom55 ~ als yon Plastoeyanin nStig ist. Es ist gleichgtiltig, welches Elektronendonatorsystem verwendet wird (DAD, D C P I P oder TMPD). TMPD ist also in tteptan-behandelten Chloroplasten ein guter Elektronendonator fiir die NADP-Reduktion, im Gegensatz zu Ultraschall-beh~ndelten oder

Plastocyanin und Cytochromfim Elektronentransport

153

Tabelle 7. Fehle~ einer additiven Wir}ung yon Plastocyanin und Cytochromss~ bei limitierender und 8~ttigender Konzentration in der NADP-Reduktion in Heptanbehanddten Chloroplasten (15 min Licht in N~ mit 0,2 ttMol TMPD und 10 #Mol Ascorbat) ~Mol 5IADPH~ gebfldet 0,45 m~MolPlastocyanin 3,00 m~Mol Cytochrom~52 0,45 m~Mol 1)lastocyanin~- 3 m~lKolCytochrom~ 1,50 m~MolPlastocyanin 20,00 m~Mol Cytochrom~ 1,50 m~MolPlastocyanin ~- 20 m~Mol Cytochrom~

1,5 1,1 1,2 2,6 3,2 3,0

Digitonin-fragmentierten Chloroplasten, in denen die l~ate des TMPDSystems fiberraschend klein ist. Ascorbat allein ist weder in Digitoninnoch in tteptan-behandelten Chloroplasten, im Gegensatz zur Ultraschallbchandlung, ein guter Elektronendonator. Eine O~-Entwicklung ist in diesen Heptan-Partikeln ~uch nach Zugabe yon Plastocyanin nicht mSglich. Zugabe von Plastoeyanin und Cytoehrom552 gleichzeitig fiihrt nieht zu einer ErhShung der Rate der NADP-l%eduktion, weder bei Ss noeh bei suboptimalen Konzentrationen (Tabelle 7). Das Fehlen einer ~dditiven Wirkung haben auch LIG~TBODY und K ~ O G M ~ (1967) in einem System aus Anabaena beobachtet. Diskussion Die Rolle der Cytochrome im photosynthetischen Elektronentransport wurde haupts~chlieh mit spektroskopisehen Methoden in intakten Algen oder Chloroplasten aus hSheren Pflanzen untersucht, weft Cytochrome im allgemeinen fest in der Struktur verankert sind (s. Ubersicht yon DcYsn~s, 1964). Cytoehroms~ 2 aus Euglena und Cytoehroms~4 aus Blaualgen sind jedoeh wasserlSslich und kSnnen deshalb leichter in reiner Form isoliert werden (P~mI~I et a]., 1964; Suso~ und KROGMA~N, 1966; HOLTO~ und M r ~ s , 1963 und 1967). KATO~ und SAN PIETnO (1967) zeigten kiirzlich, da$ bei der Pri~paration yon Chloroplasten aus Euglena das Cytochroms~2 herausgewaschen wird und erst sein Zusatz die photosynthetische NADP-Reduktion in Euglena-Chloroplasten mSglich macht. Fiir biochemische Untersuehungen zur l~olle des P1astocyanins im Elektronentransportsystem werden fragmentierte Partikel aus Chloroplasten oder Bl~ualgen herangezogen, in denen bei der Fragmentierung Plastocyanin bUS der Struktur herausgelSst worden ist. Dafiir stehen jetzt

154

E. ELSTI~I~,E. PIStOl,IllS, P. B6o~I~und A. TREBST:

drei Fragmentierungsmethoden zur Verffigung: Behandlung mit Ultraschall, Detergentien (Digitonin oder Triton) und tIeptan. Die Ultraschall-Behandlung yon Chloroplasten aus Spinat oder Brassica, die zuerst yon KATOHund T~KAmYA (1965) und KA~o~ nnd SAN PI~T~O (1966) auf diese Problemstellung angewende~ wurde, fiihrt unter geeigneten Bedingungen zu Partikeln, in denen die Lichtreaktion II, d.h. die Photooxydation des Wassers, noch ak~iv ist. Wie KATO~ nnd 8A~PIETRO (1966) und JACOBI(1967) zeigten, reduzieren Ultraschall-Partikel Ferricyanid unter 02-Entwicklung mit einem pH-Optimum unter 7,0. Dieses Ferricyanidsystem wird k~um durch Plastooyanin-Zusatz stimuliert (s. auch Tabolle 1), so dab sehr wahrscheinlich hier nur Lichtreaktion II be~eiligt is~. Im Gegensatz zur Ferrioyanid-Reduktion wird die NADP-Reduktion, die aus Grfinden des Redoxpotentials beide Liohtreaktionen braucht, duroh Plastocyanin stimnliert. Unsere Versuche hier zeigen, dab in Ultraschall-behandelten Chloroplastenfragmenton die O2Entwioklung und die dazu st6ohiometrische NADP-Reduktion sowohl durch Plastooyanin als auch durch Cytochrom552 aus Euglena stimuliert wird. Cytochrom552 erreioht allerdings bei pH 7,4 nur etwa 75%, bei pH 8,0 sogar nut etwa 30 % der Stimnlierungsrate von Plastooyanin. Die NADP-Reduktion in Ultraschall-Partikeln aus Chloroplasten auf Kosten eines kfinstliohen Elektronendonators, wio DCPIP/Ascorbat, DAD/ Ascorbat oder TMPD/Ascorbat, wird jedoch, unabh~ngig vom pHWert, durch Cytochrom552 genauso gut wie durch Plastocyanin stimuliert. Die Konzentrationen yon Cytochrom552, die zur maximalon Stimulierung notwendig sind, liegen um den Faktor 10 hSher als die yon Plastocyanin. D~s gleicho ergaben auoh kiirzlich Versuche yon Lm~T~ODYund K ~ o o ~ A ~ (1967) in Ultraschall-Partikeln aus Anabaena. Auch hier stimulierten Plastocyanin und Cytochrom554 aus Anabaena die NADPReduktion auf Kosten eines Donorsystems in einem um den Faktor 10 verschobenen Konzentrationsbereioh. Die Detergenz-Fragmentierung von Spinatchloroplasten mit Digitonin setzt Plastocyanin Irei (KATO~ und TAKA~Pr 1963 a und b) und inaktiviert die Lichtreaktion II [hath A~,RSO~r nnd B o ~ (1966) soll allerdings die Lichtreaktion II mit der niedertourig abzentrifugierten Partikelfraktion abgetrennt worden sein]. Die NADP-Reduktion auI Kosten eines Donorsystems wird, wie verschiedene Arbeitskreise zeigten (K~ro~r und TAK~Ir~, 1963a und b; T ~ s ~ und E L S ~ R , 1965 und 1967; W~ss~,s, 1966), duroh Plastocyanin reaktiviert./)as P~00 (= Pigmentsystem I) dieser Partikel photooxydiert sowohl Plas~ocyanin als auoh Cyfochroms~ aus Euglena (KOK et al., 1964; KoK und Ru~ca~sKI, 1965). Diese Partikel enthalton meistens noch Cytoohrom ~ (V~R~o~ et al., 1966), jedoch weniger als die unbehandelten Chloroplasten (BoA~n~ r und A~D~,~SO~, 1967), und k6nnen sogar praktisch frei yon Cyto-

Plastocyanin und Cytochrom fim Elektronentransport

155

chrom f gewonnen werden (W]~ssELs, 1966). Die NADP-Reduktion liel3 sich aber nicht durch Cytochrom f aus Spinat oder Petersilie reaktivieren (WEssELS, 1966). Wie die Versuche hier zeigen, wird jedoeh die NADPReduktion auf Kosten eines Elektronendonatorsystems, wie DCPIP/ Ascorbat oder DAD/Ascorbat, nicht nur durch Plastocyanin, sondern aueh durch Cytoehrom552 aus Euglena gleich gut reaktiviert. W~eder ]iegen die zur S~ttigung notwendigen Konzentrationen bei Cytochrom~52 um den Faktor 10 hSher als die yon Plastocyanin. Uber analoge Versuehe mit dem Detergenz Triton X 100 berichteten kiirzlich Vv,~o?r et al. (1967). Die Heptan-Extraktion von Chloroplasten entfernt das Plastochinon, so dal~ diese Methode yon mehreren Arbeitsgruppen zur Untersuehung der Rolle yon Plastochinon verwendet wurde (s. 1Jbersicht yon A ~ o ~ und C~A~E, 1965). Eine sch/~rfere Heptan-Extraktion, der eine Extraktion mit Wasser Iolgt, f/ihrt jedoch zu einer Solubilisierung weiterer Cofaktoren ( t t v , ~ r x o ~ und C~A~v,, 1967). Wie aus m~seren Versuchen hervorgeht, wird bei dieser Heptan- und Wasserextraktion auch Plastocyanin in L6sung gebracht. Die bei dieser Heptan-H20-Behandlung erhaltenen Partikel (denen der tIeptanextrakt wieder aufgedampft worden war) reduzieren NADP auf Kosten eines Elektronendonatorsystems, wenn Plastoeyanin oder Cytochrom55~ zugesetzt werden. Beide sind - - wieder in einem um den Faktor 10 versehobenen Konzentrationsbereich - - gMch gute Cofaktoren der NADP-Reduktion. In allen drei yon uns untersuchten Systemen, die dutch Fragmentierung yon Spinat-Chloroplasten gewonnen wurden, l~l~t sich also die NADP-Reduktion aui Kosten eines kiinstliehen Elektronendonatorsystems sowohl durch Plastocyanin als aueh dureh Cytochrom55~ aus Euglena in gleiehem MaBe reaktivieren. Die Reaktivierung der O2-Entwieklung in einer Hill-Reaktion mit NADP oder Anthrachinon gelingt nur in Ultraschallbehandelten Chloroplasten. Abh/~ngig yore pH-Wert ersetzt hier Cytoehrom55~ das Plastoeyanin nur teflweise. Wir sehliegen daraus, dag Plastoeyanin und Cytochroms~ 2 gleieh gute Elektronendonatoren fiir das Pigmentsystem I der Chloroplasten sind, aber Plastoeyanin der bessere Acceptor fiir die Elektronen ist, die aus der Photooxydation des Wassers dureh die Liehtreaktion I I angeliefert werden. Es erseheint uns jetzt auf Grund der vorliegenden Ergebnisse sieher, dab Plastoeyanin und Cytoehrom f in der Elektronentransportkette der Chloroplasten parallel einzuordnen sind. Dies gilt unter der Voraussetzung, dag das wasserl6sliehe C y t o e h r o m ~ aus Euglena und Cytoehromss 4 aus BlauMgen dem Cytoehrom f der hSheren Pflanze, das sieh nur durch ammoniakalisehe )[thanolbehandlung yon Bl~ttern in L6sung bringen 1/tBt, entspreehen.

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E. ELSTNER, E. I~ISTORIUS,P. B()GER und A. TREBST:

Es bleibt dann die Frage, warum es zwei Donatoren ftir das Pigmentsystem I tier Photosynthese gibt. Es w/~re denkbar, dab je nach Anzuehtbedingungen (Verh/~ltnisyon angebotenen Kupfer- nnd Eisensalzen) versehiedene Mengen Plastocyanin und Cytoehrom f in Chloroplasten vorhanden sind und sich die beiden Substanzen die gleiche Funktionsstelle teilen. Dies w~re analog dem naeh TgEBST und BOTH]~ (1966) bei Eisenmangel in Anacystis auftretenden Phytoflavin (SM~LLI~,1963 und 1965), das Ferredoxin zu ersetzen vermag. Eine andere Erkl/~rnngsm6gliehkeit w/~re, dag es in den Chloroplasten in vivo zwei r/iumlieh getrennte, aber chemisch gleiche Pigmentsysteme I gibt, yon denen eins Plastoeanin, das andere Cytochrom f als Elektronendonator verwendet. Das eine Pigmentsystem I i s t fiber eine Reihe yon Redoxcarriern mit dem Pigmentsystem II, also dem 02-entwickelnden System, gekoppelt, w/ihrend das andere Pigmentsystem I nur einen eyclischen Elektronentransport bewirkt. Wir mSehten vorschlagen, daft Plastoeyanin der Elektronendonator ffir Pigmentsystem I in dem offenkettigen System ist. Eine Stiitze dafiir k6nnte man darin sehen, dab Plastocyanin bei sehr geringen Konzentrationen die Kopplung der beiden Liehtreaktionen in Ultrasehall-Partikeln besser bewerksteUigt als Cytoehrom552, vor allem bei pH 8,0, dem Optimum der mit einer ATP-Bildung gekoppelten Hill-Reaktion. Plastocyanin ist in Ultraschall-behandelten Partikeln deutlich der bessere Aeceptor fiir die Elektronen, die aus der Photooxydation des Wassers durch Liehtreaktion II angeliefert werden. Plastocyanin und Cytochrom~52 sind in den gleiehen Partikeln dagegen gleich gute Donatoren ffir Pigmentsystem I, denn, wenn ein kiinstliches Elektronendonatorsystem start der Photooxydation des Wassers verwendet wird, stimulieren beide die NADP-Reduktion gleieh gut. Auch die Ergebnisse mit photosynthetiseh aktiven Praparationen aus Blaualgen geben Hinweise dafiir, dab Plastocyanin und nicht Cytochrom f die beiden Lichtreaktionen miteinander verbindet. Denn beim Lyophilisieren yon Anacystis werden die wasserlSsliehen Cytoehrome, darunter das Cytochrom554, aus den Partikeln entfernt (ttOLTO~ und MY~s, 1963). Diese lyophilisierten Partikel kSnnen jedoeh weiterhin bei Belichtung in einer HillReaktion mit K-Ferrieyanid oder NADP O2 entwiekeln (G~HA~DT nnd T ~ s T , 1965). Die NADP-Reduktion bei Verwendung eines kfinstliehen Elektronendonatorsystems wird dagegen - - naeh Entfernung des endogenen Plastoeyanins - - sowohl dureh Plastocyanin wie dutch Cytochrom554 stimuliert (LIGHTBODYund K~oG~[A~, 1967). Nach der heutigen Lehrmeinung ist Cytoehrom f der electron carrier, tier die beiden Liehtreaktionen miteinander verbindet und der unmittelbare Donor fiir Pigmentsystem I. Obwohl umfangreiehes Material zur Stiitze dieser Vorstellung angesamme]t zu sein seheint (s. Obersieht DuYsENs, 1964), beobachteten A ~ s z und D u Y s ~ s (1962) und

Plastocyanin und Cytochrom f i m Elektronentransport

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DuYs~Ns (1963), dal3 d e r Q u a n t e n b e d a r f ftir die C y t o c h r o m f-Photoo x y d a t i o n grSl3er ist als fiir die lkTADP-Reduktion. D a n a e h muir mindestens noeh ein weiterer D o n o r fiir P i g m e n t s y s t e m I existieren. Cytoe h r o m f w~re n a c h unserer Vorstellung der E l e k t r o n e n d o n a t o r ffir Pigm e n t s y s t e m I in d e r cyclischen P h o t o p h o s p h o r y l i e r u n g m i t F e r r e d o x i ~ als C o f a k t o r (TAoAWA et el., 1963) [ F e r r e d o x i n w i r d als der physiologische C o f a k t o r der eyclisehen P h o t o p h o s p h o r y l i e r u n g angesehen, w ~ h r e n d alle a n d e r e n b e k a n n t e n Cof~ktoren n u r die offenkettige E l e k t r o n e n t r ~ n s p o r t k e t t e zu e i n e m eyelisehen S y s t e m kurz schliel~en]. Dieses cyclisehe S y s t e m wfirde bei Z u g a b e eines kfinstliehen D o n a t o r s y s t e m s u n d v o n 5~ADP u n d F e r r e d o x i m N A D P - R e d u k t a s e als A c c e p t o r e n in ein offenes S y s t e m u n g e w a n d e l t w e r d e n kSnnen. Die N A D P - R e d u k t i o n bei V e r w e n d u n g des kfinstlichen D o n a t o r s y s t e m s k a n n deshMb sowohl d u r c h P l a s t o e y a n i n wie d u r c h C y t o e h r o m f s t i m u l i e r t werden.

Methodik Die Versuche wurden mit ,,broken chloroplasts" yon Spinet durchgefiihrt. Sie wurden naeh ALLEN et ~l. (1959) dureh Zerreiben yon Spinatbl~Lttern in 0,35 m NaC1 + 10 % 0,2 m Trispuffer pH 8,0 und DifferentiMzentrifugation gewonnen. Die so erhaltenen ganzen Chloroplasten wurden in Wasser osmotiseh aufgebroehen und die Chloroplastenfragmente hoehtourig vom wSi]rigen Chloroplastenextrakt abzentrifugiert. Diese Chloroplasten wllrden, wie unten beschrieben, mit Ultraschall, Digitonin oder tIeptan behandelt. Die photosynthetischen Reaktionen warden in konischen Warburg-Gef~lten von etwa 14 m ] / n h a l t bei 15~ C durchgefiihrt. Jedes Gef~I3 enthielt in eiaem Gesamtvolumen yon 3 ml folgende Substanzen in i~Mol: Trispuffer mit den in den Tabellen angegebenen pH-Werten 80; MgC125; ADP 10; ~norg~nisehes Phosphat 10; K-Ferrieyanid 20 bzw. NADP 6 + Ferredoxin 0,01 ; die jeweiligen Chloroplastenfr~gmente mit einem Chlorophyllgeh~lt yon 0,4 mg und die in den Tabellen angegebenen Zus~tze. In den Versuchen mit Ultraschall beh~ndelten und mit Digitonin fr~gmentierten Chloroplasten wurden in der NADP-Reduktion s~ttigende Mengen der Ferredoxin-NADP-Reduktase zugesetzt. Nachdem die Get,Be mit N 2 oder Luft ~quilibriert worden waren, wurde mit 35000 Lux (Philips-Attr~lux-Lampen) belichtet. Die Oe-Entwicklung wurde manometrisch verfolgt. Naeh der Beliehtung wurden die Proben hochtourig abzentrifugiert und NADPH 2 im ()berstand bei 340 m~ bestimmt. Ultraschall-behandelte Chloroplasten. 10 Inl einer Chloroplastensuspension mit 0,2 mg Chlorophyll/ml 0,02 m Trispuffer pH 7,4 wurden 30 see in Eis mit Ultrasctmll bei 4 Ampere (Ger~t: Branson Sonifier) beh~ndelt, mit NaC1-L6sung auf 0,05 m NaC1 eingestellt und dann 30 min in der Ultrazentrifuge bei I00000 g zentrifugiert. Dus Pellet wurde in 0,02 m Trispuffer pH 8,0 resuspendiert. Digitonin-]ragmentierte Chloropl~ten. Digitonin-fragmentierte Chloroplasten w a r d e n - wie beschrieben (TI~EBST und EI,ST~EI~, 1967) - - d u r c h hMbstfindige Behandlung yon ,,broken chloroplasts" mit einer 1%igen Digitonin-L5sung und anschliel]ender Ultrazentrifugation gewonnen. Heptan-behandelte Chloroiolasten. Heptan-behundelte Chloroplasten wurden in Anlehnung an die Vorsehrift yon HE~II~GER und CI~A~ (1967) gewonnen. Dazu wurden lyophilisierte Chloroplasten 45 mill mit der 10faehen Menge n-Heptan bei

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30~ geschtittelt. Der Heptanextrakt wurde ansehliel]end auf einem BfichnerTrichter yon den Chtoroplasten abgesaugt. Nach dem Trockensaugen der Chloroplasten wurde der eingeengte, gelbe Heptanextrakt wieder zugese~z~ und das Heptan unter Vakaum abgezogen. Diese Chloroplasten wurden dann mif 0,05 m Trispuffer pH 8,0 d- 0,015 m NaC1 gewasohen, abzentrifugiert und im gleichen Puffer wieder aufgenommen. Im Gegensatz zu der Digitonin-Behandlung setzt die HeptanWasser-Behandlung die Ferredoxin-NADP-Reduktase nicht frei, so dab das Enzym in diesen Versuohen nieht zugesetzt zu werden braueht. Herstellung von Plastocyanin aus Spinatbliittern. 1. Der lJberstand der Partikelzentrffugation nach Digitonin-Behandlung yon Spinatchloroplasten enthglt das Plastocyanin und kann daraus - - wie beschrieben (KAToE and TAKAMIYA,1963b; TEEBST und ELST~ER, 1967) - - gewonnen werden. 2. Bei der Heptan- und Wasserbehandlung von Chloroplasten nach HENmNOER und CRAWls(1967) geht das Plastoeyanin in den w~Srigen ~berstand und kann daraus gewonnen werden. Nach dem Absaugen des Heptanextraktes und dem Trocknen werden die so erhaltenen Chloroplastenpartikel mit 0,05 m Trispuffer p i t 8,0 und 0,015 m CN 10 min bei Zimmertemperatur gertihrt und dana 10 rain bei 40000 g abzentrifugiert. Der w~Srige Uberstand enth~ilt unter anderem Plastocyanin, das fiber sine Ammoniumsulfatf~Uung und eine DEAE-S~iule in Anlehnung an KATOE und TAK~IYA (1963b)weiter angereichert und gereinigt werden kann. Ausbeute: etwa 60 m~Mol Plastoeyanin aus 750 g Spinat. 3. Naeh dem Aufarbeitungsgang zur Gewinnung yon Ferredoxin und Ferredoxin-NADP-Oxydoreduktase nach S~I~ et al. (1963) erfolgt nach der Aeetonf~llung eine erste Trennung yon Ferredoxin und Ferredoxin-NADP-Oxydoreduktase auf einer DEAE-SEule, die mit 0,1 m Trispuffer pH 7,3 (0,2 m C1-) vorbehandelt wurde. Das Ferredoxin wird im oberen Tell der S~ule adsorbier~, w~hrend der gelbe Darchlauf unter anderem die Ferredoxin-NADP-Oxydoreduktase enth~ilt. Dieser Durehlauf enthiilt aueh grol~e Mengen Plastoeyanin. Zu seiner Gewinnung wird er dialysiert und erneut auf sine DEAE-Saule (1,5 • 10 cm), die mit 0,03 m Trispuffer pH 7,3 vorbehandelt warde, aufgetragen. Im oberen Tell der S~ule wird eine rotbraane Zone (sin Rest Ferredoxin ?) und darunter eine grau-violette Zone sichtbar, wahrend der gelbe Durchlauf unter anderem die Reduktase enthalt, die wie iiblich weiter angereiehert wird. l~achdem die Saule mit 0,03 m Trispuffer pH 7,3 gewasehen wurde, kann die grau-violette Zone mit 0,2 m Phosphatpuffer pH 7,0 eluiert werden. Ein Tropfen FerrieyanidlSsung farbt das Eluat tiefblau. Die weitere Anreieherung und Reinigung erfolgt nach der Methode yon KATO~ und TAKAMIYA (1963b). Ausbeute: etwa 100 m~Mol Plastocyanin aus 2000 g Spinat. Der Gehalt an Plastocyanin wurde aus der Extinktion bei 597 m~ Und einem Extinktionskoeffizienten yon 9,8" 103 (KAToH and TAKAMIYA,1964) berechnet. Herstellung vo~ Cytochrom55 ~ aus Euglena. 17 1 Kultursuspension autotroph gezogener Euglsna gracilis, StammZ ( 3 ~ • l0 s Zellen/ml) wurden abzentrifugiert (zur Kultur s. BSGER und SAN PIET~O, 1967), die Zellen einmal mit 0,9%igem NaC1 gewaschen und in 500--600 ml Koehsalzl5sung gleicher Konzentration suspendiert, die noch 0,01 m Tris-HC1-Puffer pH 8,0 enthielt. Die Suspension wurde eingefroren, bei 10--20~ C wieder aufgetaut und der Vorgang zweimal wiederholt. Der nach Zentrifugieren (10 rain bei 20000 g) gewonnene brauuliche Uberstand wurde auf eine mit 0,01 m Tris-HC1-Puffer p it 8,0 aquilibrierte DEAE-CelluloseS~ule (4 • 10 era) gegeben. Das Cytochromss~ verbleibt zusammea mit dem Ferredoxin im oberen Teil. Naeh griindtiehem Waschen mit 0,1 m NaCt (500 ml) wurde das Cytoehrom mit 0,2 m NaC1 eluiert (beide SalzlSsungen enthielten 0,01 m Trispuffer pH 8,0).

Plastocyanin und Cytochrom f i m Elektronentransport

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Das rStliche Eluat wurde gegen 0,01 m Tris-HC1-Puifer pH 8,0 dialysiert und erneut in gleieher Weise fiber DEAE-Cellulose gereinigt (SEule 2• 10 era). Das VerhEltnis der Absorptionsmaxima 416m~z/552miz des eluierten Cytochroms n~herte sich in der Regel bereits nach diesem Reinigungsschritt dem yon PERIiNI et al. (1964) angegebenen Wert. Anderenfalls wurde nochmals fiber eine dritte S~ule gereinigt. Die Konzentration an Cytochrom wurde aus der Extinktion bei 552 mix und einem Extinktionskoeffizientenyon 2,17-104 (KAToH, 1960a) berechnet. Wir sind der Deutschen Forschungsgemeinschaft ffir ihre Unterstfitzung dankbar. Literatur A~ESZ, J., and L. N. M. DUYSENS: Action spectrum, kinetics and quantum requirement of phosphopyridine nuoleotide reduction and cytochrome oxidation in the blue-green alga Anacystis nidulans. Biochim. biophys. Acta (Amst.) 64, 261--278 (1962). ANDERSON, J.M., and N.K. ]3OARD-~AN: Fractionation of the photochemical systems of photosynthesis. I. Chlorophyll contents and photochemical activities of particles isolated from spinach chloroplasts. ]3iochim. biophys. Acta (Amst.) 112, 403--421 (1966). AR~cON,D. I., and F. L. CRA~E: Role of quinones in photosynthetic reactions. In: Biochemistry of quinones, p. 433--458 (ed. R. A. MORTON). London and New York: Academic Press 1965. BOAgD)~A~T, N.K., and J.M. AND~gSON: Fractionation of the photochemical systems of photosynthesis. II. Cytochrome and carotenoid contents of particles isolated from spinach chloroplasts. ]3iochim. biophys. Aeta (Amst.) 143, 187-203 (1967). B6CER, P., and A. SAm PIETI~O: Ferredoxin and Cytochrome f in EugIena gracilis. Z. Pflanzenphysiol. 58, 70--75 (1967). DAVENPORT, H. E., and R. HILL: The preparation and some properties of cytochrome f. Proe. roy. Soc. ]3 139, 327--345 (1952). DuYsE~-S, L. N. M.: Role of two photosynthetic pigment systems in cytochrome oxidation, pyridine nucleotide reduction, and fluorescence. Proc. roy. Soc. B 157, 301--313 (1963). - - Photosynthesis. Progress in biophysics, vol. 14, p. 1--104. Oxford-LondonEdinburgh-New York-Paris-Frankfurt: Pergamon Press 1964. FOICK, D. C., and W. URBACH: Evidence for the localization of plastocyanin in the electron-transport chain of photosynthesis. Proe. nat. Acad. Sci. (Wash.) 53, 1307---1315 (1965). GERKARDT, ]3., and A. TREBST: Photosynthetische Reaktionen in lyophilisierten Zellen der ]31aualge Anacystis. Z. Naturforsch. 20b, 879--885 (1965). GORMAN,D. S., and R. P. LEVITE: Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proe. nat. Acad. Sci. (Wash.) 54, 1665--1669 (1965). --Photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. VI. Electron transport in mutant strains lacking either cytochrom%a a or plastocyanin. Plant Physiol. 41, 1648--1656 (1966). H~x~iI~O~l~, M. D., and F. L. CI~ANE:Electron transport in chloroplasts. III. The role of plastoquinone c. J. biol. Chem. 242, 1155--1159 (1967).

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