Eur. J. Biochem. 63, 391 -398 (1976)

Structure de la mycosubtiline, antibiotique isole de Bacillus subtilis Franqoise PEYPOUX et Georges MICHEL Laboratoire de Biochimie Microbienne, Universite de Lyon I, Villeurbanne Lucien DELCAMBE Centre National de Production et d’Etude des Substances d’Origine Microbienne, Liege ‘(Requle 8 octobre/6 novembre 1975)

The Structure of Mycosubtilin, an Antibiotic Isolated f r o m Bacillus subtilis

Mycosubtilin, an antifungal agent isolated from Bacillus subtilis is a mixture of homologous lipopeptides essentially C54H,,N,,O16 and C&&14O,,. The differences in their structures was found in the lipid moiety which contains several fi-amino acids; the structure of these p-amino acids was demonstrated by combined gas chromatography-mass spectrometry of the N-trifluoroacetyl n-butyl esters; a strong peak at m/e = 240 indicates a fi-amino group. The comparison of the derivatives of natural amino acids with synthetic 3-aminohexadecanoic and 3-aminoheptadecanoic acids indicates that natural j-amino acids are a mixture of 3-amino-14-methylpentadecanoicacid (35 %), 3-amino-14-methy1hexadecanoicacid (59 %), 3-aminohexadecanoic acid (6 %) and a trace of CISfi-amino acid. The peptide moiety contains 8 moles of amino acids, two of D-asparagine, two of L-asparagine, and one of L-glutamine, L-proline, D-serine and D-tyrosine. The peptide sequence was determinated by partial acid hydrolysis of mycosubtilin and isolation and structural determination of the peptides from the hydrolysates. Four liposoluble peptides and four hydrosoluble peptides were studied. The results gave the cyclic structure shown on Formula 1 for mycosubtilin. Plusieurs antibiotiques de nature polypeptidique ont ete isoles de souches diverses de Bacillus subtilis: les bacillomycines A [l] B [2] C [3] et R [4], l’eumycine [5], la mycobacilline [6], les subsporines [7], la mycosubtiline [S], l’iturine [9- 111 et la toximycine [12]. Leur structure est, pour la plupart d’entre eux, encore indeterminee mais les analyses d’acides amines indiquent certaines similitudes de composition. Les acides aspartique et glutaniique, la serine, la proline et la tyrosine sont les constituants les plus frequents avec quelques autres acides amines variables suivant I’antibiotique. Cependant ces analyses ont parfois Cte effectuees sur des produits insuffisamment purifies et seules les structures completes de la mycobacilline [I31 et de l’iturine [14] sont actuellement connues. Ces composes prksentent un spectre d’activite antifongique etendu et certains d’entre eux possedent egalement une activite antibacterienne reduite. C’est ainsi que l’eumycine est active sur Corynebacterium diphteriae, la mycosubtiline sur Micrococcus luteus, la bacillomycine A sur Klebsiella pneumoniae, la bacillomycine B sur Staphylococcus uureus, l’iturine AhrPviutions. Dnp-, dinitrophtnyl-; Dansyl-, dimtthylaminoiiaphtdlenesulfonyl-.

sur Corynebacterium diphleriae et Sarcinu lutea, la toximycine sur Bacillus cereus, Micrococcus pyogenes et Xanthomonas campestris. Nous avons determine la structure de la mycosubtiline isolee de Bacillus subtilis 370 par Walton et Woodruff [8]. MATERIEL ET METHODES Produits La mycosubtiline nous a ete fournie par le Dr H. B. Woodruff(Merck and Company, Rahway, New Jersey, U.S.A.). La D-amino acide oxydase provient de Worthington Biochemical Corporation, La L-glutamate dkcarboxylase et la L-glutamate oxalacetate transaminase de Sigma Chemical Company. Les divers rkactifs et produits utilises proviennent soit de E. Merck A G soit de Fluka A.G. Etude des constituants liposolubles L’analyse des acides amines liposolubles a ete effectuee par chromatographie gazeuse couplee avec la spectrometrie de masse des N-trifluoroacktyl-nbutylesters prepares selon Roach et Gehrke [I 51.

Structure de la mycosubtiline

392

La phase stationnaire est l’ethyleneglycol adipate (0,65%) sur Chromosorb W ; la temperature est programmee de 150 a 200 “C ou de 80 a 200 “C. La spectromttrie de masse a egalement ete realisee sur les esters methyliques N-ac6tyli.s prepares par action du melange anhydride acetiquelmkthanol (113, en vol.) pendant 1 h puis action du diazomethane en solution Cthkree. Synthise des acides aminks liposoluhles

Les acides P-aminohexadbcanoique et /?-aminoheptadecanoique ont ete synthetises respectivement a partir du tetradecanal et du pentadecanal. Le tetradecanal commercial provient de Fluka, le pentadkcanal a ete prepare a partir du chlorure de pentadecanoyle [ 161. 500 mg de chlorure de pentadecanoyle, en solution dans 10 ml de xylkne sont hydrogenes en presence de 60 mg de catalyseur (Pd-BaSO,), 30 min a 135 “C. La vitesse de la reaction est contrhlee par le degagement de l’acide chlorhydrique. Le rendement est de 95 Les aldehydes sont condenses avec le bromacktate d’ethyle en presence de zinc puis on fait agir une solution azeotropique d’acide bromhydrique en presence d’acide sulfurique concentre. Le derive brome obtenu est ensuite traite par un excks d’ammoniaque. Les operations ont CtC dkcrites prkcedemment [17].

x.

Etude des peptides

Differents peptides ont kt6 obtenus par des hydrolyses partielles de la mycosubtiline. Les peptides liposolubles ont ete separes et purifies par chromatographie sur couches minces de gel de d i c e 60 dans les solvants : chloroforme/methanol/eau (56/24/3, en vol.) et butanol/acetone/eau (16/20/4, en vol.). Les peptides hydrosolubles ont etC isoles par chromatographie sur papier dans pyridine/alcool amylique tertiairei eau (35135130, en vol.). Une deuxieme purification est effectuee dans butanol/acide acktique/eau (50/10/ 20, en vol.) ou butanol/pyridine/acide acetique/eau (30/20/6/24, en vol.). L’aminoacide N-terminal des peptides liposolubles a ete determine par la mtthode de dinitrophenylation [21] suivie d’une hydrolyse par HC1 6 N 8 h a 150 “C en tube scelle. Les Dnp-aminoacides sont chromatographies sur gel de silice 60 dans le solvant chloroforme/methanol/acide acetique (921513, en vol.). L’aminoacide N-terminal des peptides hydrosolubles a kt6 identifie sous forme de derive dansyle prepare selon la methode de Gray et Smith [22]. L’hydrolyse des peptides hydrosolubles est effectuee par HC1 6 N 16 h a 105°C. Les dansyl aminoacides sont chromatographies sur gel de d i c e 60 dans le solvant benzene/pyridine/acide acetique (201511, en vol.). La sequence N-terminale est determinee par degradation d’Edman selon Gray et Smith [22]. L’aminoacide terminal est identifie par dansylation aprks chaque cycle de degradation.

Etude des aminoacides hydrosolubles

Les amino acides hydrosolubles ont Cte analyses par chromatographie sur couche mince de poudre de cellulose MN 300 G dans les solvants : isopropanol/ pyridineiacide acetiqueieau (40/40/5/20, en vol.) et pyridineialcool amylique tertiaireieau (35/35/30, en vol.). La revelation est effectuee par la ninhydrine preparee selon Russel [ 181. L’analyse quantitative des amino acides a ete effectuee soit a l’autoanalyseur Technicon selon la methode de Piez et Morris [lY], soit par la mtthode des Dnp-derives de Ghuysen et al. [20]. La configuration optique des amino acides a Ctt determinee par les mtthodes enzymatiques [14]. La configuration optique de la skrine, de la proline et de la tyrosine a ete determinee par action de la D-aminoacide oxydase a pH 8,2 pendant 2 h a 37 “C. La configuration de l’acide glutamique a ete determinee par action de la L-glutamate decarboxylase a pH 4,5 pendant 1 h 30 min a 37 “C. La configuration de l’acide aspartique a ete determinee par incubation en presence de L-glutamate-oxalacitate transaminase et de 2-oxoglutarate a pH 7,6 pendant 21 h a 37 “C. Apres action des enzymes, I’acide glutamique ou l’acide aspartique restant sont doses par 1es Dnpderives.

Dhtermination de la prPsence de risidus d’asparagine et de glutamine

La technique utilisee est celle de Ressler et Kashelikar [ 2 3 ] . La mycosubtiline en solution dans le triethylphosphite est traitke par l’ethylene chlorophosphite 22 h A 98 “C. Le residu, en solution dans le methanol, est reduit par action du sodium dans l’ammoniac liquide. Apres dessalification et hydrolyse, l’acide diaminobutyrique et l’ornithine sont doses par la mkthode des Dnp-derives. Oxydution chrornique de la mycosubtiline [24]

0,5 mg de mycosubtiline sont oxydes pendant 22 h a 25 “C par 100 pl d’une solution a 3% d’anhydride chromique dans le melange acide acetique distill6 sur CrOJpyridine (3011). Aprks hydrolyse a 150 “C pendant 8 h l’hydrolysat est passe sur Dowex-2 (X 8) et chromatographie sur papier dans pyridine/ alcool amylique tertiaire/eau (35/35/30, en vol.). Electrophoreses

Les electrophorkses ont etk effectuees sur papier Whatman no. 3 avec un appareil Pherograph dans un

F. Peypoux, G. Michel, et L. Delcambe

tampon pyridine/acide acttique/eau de pH 4,1 ou dans un tampon Tris-HCI de pH 8,l.

RESULTATS La mycosubtiline se comporte comme un produit homogene par chromatographie en couches minces de gel de silice 60 dans les solvants butanol/acide acetique/eau (4/1/2) RF = 0,53, chloroforme/methanoljeau (65/25/4) RF = 0,28 et chloroforme/methanol/ animoniaque 7 N (65/35/5) RF = 0,28. Le spectre infrarouge prksente les bandes caracteristiques de la liaison peptidique A 1530, 1650 et 3250 cm-I et ne presente aucune bande de la fonction ester, on note en particulier l’absence d’absorption a 1740 cm-I. Par hydrolyse avec HC16 N a 150 “C pendant 6 h elle est scindee en une fraction hydrosoluble renfermant des acides amines et une fraction liposoluble extraite par le chloroforme.

ANALYSE DES CONSTITUANTS

Identification des acides aminds hydrosoluhles

Les acides amines sont identifies par chromatographie sur couches minces de cellulose dans plusieurs solvants et par chromatographie sur echangeurs d’ions a l’autoanalyseur Technicon. Le dosage donne les rapports molaires suivants : Asp,,,, Glu,, Pro,, Ser,,,, Tyro.,. La configuration optique des aminoacides a ete determinee par les methodes enzymatiques (voir Materiel et Mtthodes). La skrine, la tyrosine, et deux moles d’acide aspartique ont la configuration D ; la proline, l’acide glutamique et deux moles d’acide aspartique ont la configuration L. La presence d’asparagine et de glutamine a ete demontree par dkshydratation puis reduction de la mycosubtiline (voir Materiel et Methodes). Apres hydrolyse, l’acide diaminobutyrique provenant de l’asparagine ct I’ornithine provenant de la glutamine ont ete doses sous forme de Dnp-derives. Les rapports molaires sont les suivants: Dab,, Om,. Tous les groupements carboxyles lateraux presents dans la mycosubtiline sont donc amides. La formule brute de la fraction peptidique est la suivante: L Asn,, D Asn,, L Gln,, L Pro,, D Ser,, D Tyr,. Structure de la fraction Lbidique

La fraction lipidique obtenue apres hydrolyse acide represente 20 % du produit initial. Par chromatographie sur gel de silice 60 avec chloroformejmCthanol/ eau (65/25/4) elle donne une tache revelable a la ninhydrine. Le comportement chromatographique

193

est identique ii celui des acides p-amines isolts prectdcmment de l’iturine [17]. Une etude structurale prkliminaire par spectrometrie de masse a ete effectuee sur la fraction lipidique totale et sur l’ester methylique de la fraction lipidique N-acktylee. La fraction lipidique donne un pic moleculairc a m/e = 285 correspondant a un compose C,,H,,(NH,) -COOH et un pic homologue a m / e = 271 correspondant a un compose C15H3,,(NH2)- COOH. Le spectre de masse de la fraction lipidique N-acktylee et mbthylee sur la fonction carboxyle donne 2 pics moleculaires a m/e = 341 et 327 correspondant respectivement aux composes C16H32(NH - COCH,)COOCH, et C,,H,,(NH - COCH,) - COOCH,. On trouve sur le spectre les pics caracttristiques d’une fonction amine en p du carboxyle. Le pic de base est situk a rnje = 102, il correspond au fragment [NH, = CH-CH,-COOCH,]’, un pic important a m / e = 144 correspond a [CH,-CO-NH = CH - CH, - COOCH,]’ . On observe egalement plusieurs groupes de pics homologues A rnje = 298 et 284 (M’ - (CH,CO)] l’intensite de ces pics est en faveur d’un groupement amine en p [17], i m/e = 268 et 254 [M’ - (CH,COOCH,)], a mje = 226 et 212 provenant des pics precedents par depart de CH,CO. Les N-trifluoroacttyl-n-butylesters des acides aminks homologues ont Cte separes par chromatographie gazeuse sur ethyleneglycol adipate. Lc chromatogramme est prksente a la Fig. 1. On observe deux pics principaux XI (35%) et X, (5973, un pic plus faible X2 (6‘79 et un dernier pic a l’etat de trace X,. Le couplage de la chromatographie gazeuse avec la spectronittrie de masse a donne les spectres des 4 derives. Les spectres de masse des derives X, et X,, quantitativement les plus importants sont indiques aux Fig. 2 et 3. Les pics moleculaires a mje = 423 pour X, et a mje = 437 pour X3 correspondent respectivement ii des derives d’aminoacides en C,, et CI7. Le pic de base a rnje = 240 provient de la coupure de la chafne paraffinique en a du groupement amide et correspond au fragment [CF,CO - N H = C H - CH, - COO(CH,),CH,]’, la deuxieme fragmentation en (x de la fonction amide donne les pics homologues a m / e = 308 pour X, [C,,HZ7-CH = NH-COCF,]’ et a rnje = 322 pour X, [C,,H,, - CH = NH - COCF,]+ . De nombreux autres pics sont observes; pour certains d’entres eux, des fragmentations peuvent &re proposees A partir des resultats de Manhds et al. [25] sur les esters mithyliques des N-trifluoroacetylaminoacides: [M’ - CF,] a m/e = 354 pour XI et mjr = 368 pour X,, [M’ - O(CH,),CH,] a m / e = 350 pour XI et m / e = 364 pour X,, [M’ - COCF,] a mJe = 326 pour X, et rnje = 340 pour X,. Les pics

Structure de la mycosubtiline

394

intenses a mje = 139, 140, 166, 184 sont communs a tous les derives XI, X2, X3, X4, ils correspondent a des fragments dont la chafne paraffinique R a ete eliminee. Les fragmentations suivantes peuvent etre proposees: mje = 139 [M+ - 284 (R CO,C,H,)] 166 [M’ - 257 (R C,H,OH)], 184 [CF,CO-NH = CH - CH, - COOHI’. Le spectre du derive X2 est tres voisin de celui du derive X, avec le m2me pic moleculaire a mje = 423. Le spectre du derive X4 presente un pic moleculaire a m/e = 451 correspondant a un P-aminoacide en C18. La nature de la chaine paraffinique a ete demontree en coniparant le comportement en chromatographie gazeuse des P-aminoacides naturels et des P-aminoacides a chaine lineaire en C1, et C17 synthetises a partir des aldehydes en C,, et C15 (voir Materiel et Mkthodes). Les resultats sont indiques a la Fig. 1. Le derive de l’acide P amine en C16 synthetique posdde un temps de retention identique a celui du compose naturel Xz, ce dernier est donc un derive de l’acide p-amine en C16 lineaire, resultat en accord avec le spectre de masse. Le compose X, correspondant Cgalement a un P-aminoacide en C,, possede un temps de retention inferieur au compose synthetique, ce qui indique une chaine carbonee ramifiee. Le derive de l’acide P-arnine en CI7 synthetique a aussi un temps de retention supkrieur a celui du compose naturel X,, ce dernier possede donc une ramification

+

+

30

0

15

Temps de retention (rnin)

Fig. 1 . Chromatographie en phase gazeuse des N-trifluoroactzyln-hutyl esters, dtrivts de la fraction lipidique de la mycosuhtiline et des acides amino-3 hexadtcanoiique IS,) et amino-3 heptad&eanoiique (&) Tynth6tique.T

3! 2

F-

i

308

184

1, 150

(M-43)

I

380

I mte

Fig. 2. Spectre de masse du N-trifluoroacttyl-n-butyl ester de l’acide amino-3 methyl-I4 pentadtcanorque naturel (compost! X I )

408

395

F. Peypoux, G. Michel, et L. Delcambe

368-J 2

)

10

f184

/+ 322

(M-15) 422 340

(M-29)

408

I

I 150

200

Fig. 3. Spectre de masse du N-trifluoroacecyl-n-hutyl ester de I'acide amino-3 mlthyl-14 hexadtcanoYque nature1 (compost X 3 )

dans la chaine carbonke. La presence de 8-aminoacides ramifies a deja kt6 observee dans l'iturine qui renferme les composes is0 C14 et anteiso C,, [17]. La position de la ramification dans les composes X, et X, peut Ctre determinee a partir des spectres de masse de leurs derives (Fig.2 et 3). On observe quelques pics provenant de la coupure de la chaine paraffinique a [M' - 151, [M+ - 291, ce dernier pic est absent du spectre de XI et present dans celui de X,, par contre le pic a [M' - 43 (C,H,)] est present dans le spectre de XI et non dans celui de X3. Ces resultats sont en faveur d'une structure is0 pour la chaine paraffinique de l'acide en C,, et anteiso pour la chaine paraffinique de I'acide en C17. La partie lipidique de la mycosubtiline comprend donc essentiellement deux 8-aminoacides : l'acide amino-3 methyl-14 pentadecanoique (35 %) et l'acide amino-3 methyl-I4 hexadecanoique (59 %), avec une faible quantitk d'acide amino-3 hexadkcanofque (6 %) et des traces d'un 8-aminoacide en C18.

DETERMINATION DE LA SEQUENCE PEPTIDIQUE. ETUDE DES PEPTIDES LIPOSOLUBLES

Prkparation et analyse des peptides

La mycosubtiline hydrolyske par HC1 6 N a 110 "C pendant 18 h donne une fraction extraite par le chloroforme renfermant, outre les acides ,8-amines,

Tableau 1. R, des peptides liposolubles Chromatographie sur couches minces de gel de silice et analyse des acides amines ComposCs Solvants ~~

A B C

D

~~

Butanol/ acttone/eau (1 6/20/4)

Chloroforme/ methanol/eau (56/24/3)

0.58 0,72 0,86 -

0,52 0,71 1,o 0,33

Proportions molaires des amino dcides hydrosolubles"

ASP Asp, Glu (1 : 1) Asp, Glu (2 : I ) Asp, Glu, Ser (2 : 1 : 1)

a Les peptides A, B, C, D referment Cgalement 1 mole de 8-aminoacide liposoluble.

trois composes rCvelables ;ila ninhydrine. Une autre hydrolyse effectuee par HCl 6 N ii 110 "C pendant 72 h permet d'isoler un quatrikme compose. Chacun des composes est obtenu par chromatographie preparative sur couches minces de gel de silice. L'hydrolyse totale par HCl 6 N 8 h a 350 "C donne pour chacun des composes une fraction lipidique constituee par les acides 8-aminks liposolubles identifies precedemment. Les aminoacides hydrosolubles ont ete doses par la mtthode des Dnp-dkrjvts. Les rapports molaires sont indiques dans le Tableau 1.

396

Etude du compost: A

L‘aminoacide N-terminal identifie sous forme de Dnp-derive est l’acide aspartique. Le compose A est soumis a une degradation d’Edman. Le produit amine residue1 est dinitrophknyle puis hydrolyse, il donne uniquement les Dnp-derives des P-aminoacides liposolubles identifies par chromatographie sur couches minces de gel de silice 60 dans le solvant chloroformelmethanollacide acetique (92/5/3). La configuration optique de l’acide aspartique a ete determinee sur un hydrolysat du compose A par action de la L-glutamate-oxalacetate transaminase en presence d’acide 2-oxoglutarique. L’acide aspartique est entikrement transamink ce qui indique une configuration L. Le compose A a donc la formule: L - A S ~ + O NC,,,

Gi1. Etude du compost: B Le peptide dinitrophtnyle hydrolyse donne les Dnp-derives des p aminoacides en C,, et C17qui se trouvent donc en position N-terminale. La presence d’un p aminoacide N-terminal ne permettant pas d’effectuer des degradations d’Edman, la sequence Asp, Glu, reste indeterminee. La configuration optique de l’acide aspartique est determinee, comme prkcedemment, par action de la L-glutamate-oxalacetate transaminase sur un hydrolysat total du compost B: l’acide aspartique a la configuration L. La configuration L de l’acide glutamique avait etC determinee sur un hydrolysat total de la mycosubtiline. Le compose B a donc la structure suivante: /?NC16, C,,+(L-ASP, L-G~u).

Structure de la mycosubtiline Tableau 2. R, des peptides hydrosolubles Chromatographie sur papier Solvants

p,

p,

p,

p4

Pyridine/alcool amylique tertiaire/eau (35/35/30)

0.05

0,09

0,19

0,27

Butanol/acide acktique/eau (40/10/20)

0,19

-

0,38

-

Butanol/pyridine/acide acktique/eau (30/20/6/4)

0,35

Tableau 3. Nature de f’acide amini N-terminal de.7 peptid