Planta (Berl.) 124, 67--75 (1975) 9 by Springer-Verlag 1975
Mise en 6vidence et propri6t6s de deux formes de la 5-d6shydroquinate hydro-lyase chez les v6g6taux sup6rieurs* Alain M. Boudet, l~aymond L6cussan et Annie B o u d e t Enzymologie et M6tabolisme, Equipe de Recherche associ6e au CNRS, Universit6 Paul Sabatier-Centre de Physiologic V6g6tale, 118, route de Narbonne, F-31077 Toulase C6dex, France Regu le 16 janvier; acept6 le 10 f6vricr 1975 Characterization and Properties of Two D e h y d r o q u i n a t e H y d r o - L y a s e s in Higher Plants Summary. Two dehydroquinate hydro-lyases (E.C. 4.2.1.10) have been routinely separated from different organs of Zea mays L. by chromatography on Cellex-D Bio-Rad or hydroxypatite using linear salt gradients. Dehydroquinate hydro-lyase 1 is associated with shikimate: NADP + oxidoreductase (E.C. 1.1.1.25). DHQase 2 is a free constitutive enzyme; in this respect it differs from the inducible enzyme of microorganisms which appears only when dehydroquinate or quinate is the principal carbon source. DHQase 1 and DHQase 2 have a similar apparent Michaelis constant and pH optimum, but they differ in their molecular weight, thermal stability and sensitivity to metabolic effectors. DHQase 2 is specifically activated by shikimie acid. This strong activation and the channeling properties of the complex involved in the shikimate pathway can provide an effective means of control in the utilization of dehydroquinate between two different pathways. The significance of such a system involving both a specific regulation of isoenzymes and a molecular compartmentation by means of an enzymatic complex is discussed.
Introduction Chez les v6g6taux sup6rieurs la synth6se des acides amin6s aromatiques fair intervenir, comme chez les microorganismes, la voie de l'acide shikimique. Nous avons r6cemment montr6 que deux enzymes de cette s6quence m6tabolique la 5-d6shydroquinate hydro-lyase (E.C. 4.2.1.10) et la shikimate: I~ADP + oxydor6ductase (E.C. 1.1.1.25) 6taient associ6es chez les plantes sous forme d ' u n complexe vraisemblablement bifonctionnel (Boudet et L6eussan, 1974). Cette situation diff6re de celle constat6e chez terrains champignons qui poss6dent 5 activit6s (6tapes 2 ~ 6, sch6ma) r6unies au sein d ' u n complexe multifonctionnel (Ahmed et Giles, 1969) ou, ehez les Procaryotes pour lesquels on ne rel6ve aucune association (Berlyn et al., 1970). E n dehors de l'efficacit6 accrue due au r a p p r o c h e m e n t spatial d'enzymes op6rant s6quentiellement ees complexes p e u v e n t faciliter la r6gulation du m6tabolisme par un effet de c o m p a r t i m e n t a t i o n au niveau mol6culaire (" channeling") d'intermddiaires communs ~ plusieurs ehalnes m6taboliques. C'est le cas pour * Abrgviations: 5-d6shydroquinate hydro-lyase = DHQase; Shikimate: NADP + oxydor6ductase = SIt. ORase; Aeide 5-d6shydrosbikimique = 5-DHS; Acide 5-d6shydroquinique = 5-DHQ. 5*
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A.M. Boudet et al. Sch6ma
D-Erythrose 4-phosphate
AC.
quiaique > Ac. 3-desoxy-D. arabinoheptulosonique 7-phosphate
I Phospho6nolpyruvate
>
Ac. 5-d6shydro* quinique Ac.
5-d6shydroquinique Ae. 5-d6shydroshikimique 4
Ac. choris- < mique
Ac. 6nol. < pyruvylshikimique 5-phosphate
5
6
-~e.
acide protocat6chique (Tateoka, 1968; Marigo et al., 1969) et l~ presence du complexe bifonctionnel d6jh mentionn6 qui devrait "canaliser" l'acide D H S vers la synth~se d'acide shikimique nous ont conduits s rechercher l'existence de formes multiples de la DH Qase chez les v6g6taux sup6rieurs.
Mat6riel et m6thodes Matdrid. Les d6termin~tions portent sur diff6rents organes de Zea maya L. (var. INRA
400): seutellums d6taeh6s apr~s imbibition des semences pendant 36 h dans l'eau distill6e, parties a~riennes ou raeines pr61ev~es sur des plants de 1 ~ 2 semaines obtenus en salle conditionn6e (5000 lux, photop4riode 14 h, 25~ vermiculite arros6e de milieu de Hoagland Arnon formule C 1). Mdthodes. L'origine des substrats de r6action et les protocoles de mesure des activit6s DH Qase et SH.ORase ont d6j~ 6t6 pr6eis~s (Boudet, 1971). L'activit6 DHQase est g4n6ralement appr6ci6e pour des temps d'action de 10 ~ 15 rain pour lesquels ]~ r~action demeure d'ordre nul. Pour l'obtention de l'extrait enzymatique brut, le materiel frais (ou congel6) broy~ au
Deux formes de la 5-d6shydroquinate hydro-lyase
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11:
if1 i
Ii lO
I
T
I
I
20
31]
411
50
60
71]Fraction s
Fig. 1. Diagramme d'61ution des activit6s DH Qase et SH.ORase sur DEAE cellulose. Colonne 1 • 15 era, 6quilibr6e dans du tampon phosphate M/100 de pH 7,5. Elution par un gradient lingaire (300 ml tampon d'6quilibration --300 ml tampon phosphate M/5 de pH 7,5). Vitesse d'61ution 60 ml/h Fractions de 6 ml
mortier en pr6sence d'azote liquide est homog6n6is6 dans 5 volumes de tampon phosphate pit 7,5 0,1 M contenant 0,2% de mcrcapto6thanol v/v (Ultra Turrax). Apr~s centrifugation 15 rain s 20000g les prot6ines du surnageant sont pr6cipit6es en amenant la concentration en sulfate d'ammonium ~ 70%. Le culot de centrifugation obtenu est repris par le minimum de tampon d'extraction puis chromatographi6 directement sur Sephadex G 100 ou "dessal6" sur Sephadex G 25. La recherche des formes multiples de la DHQase a mis en jeu plusieurs m6thodes de s6paration des enzymes faisant appel s des propri6t6s diff6rentes des mol6cules prot6iques: filtration sur gel de Sephadex G 100, chromatographie sur DEAE cellulose (cellex-D Bio Rad) et sur hydroxylapatite (Biogel HTP Bio-Rad).
R~sultats AprSs filtration de l'extrait brut sur gel de Sephadex G 100 l'activit~ D H Qase est 61uge selon deux pics principaux, l'activit6 SH.ORase 6rant pr~sente au niveau du premier pic. Une chromatographie sur DEAE-cellulose conduit & une meilleure s6paration des deux formes (Fig. 1) qui existent en proportions comparables. On convient d'appeler DHQase 1 la premi6re forme 61u6e avec la SIt.ORase D t I Quase 2 la deuxibme forme, ind6pendante. Une s6paration peut ~tre 6galement obtenue par chromatographie sur hydroxylapatite mais dans ce cas l'ordre d'61ution des deux formes est invers6 (Fig. 2a). Afin d'appr6cier d'6ventuels artefacts au niveau de l'extraction celle-ci a 6t6 r6alisge selon diff6rents protocoles: homog~ngisation dans du tampon phosphate uniquement ou duns le tampon du protocole g6n6ral contenant divers protecteurs poly6thyl6ne glycol 20000 ~ 0,5%, ph6nylmgthylsulfonyl fluoride (inhibiteur des prot6ases) 0,1 mM, glycgrol s 10%. On ne eonstate dans ces conditions aucune modification des r6sultats d6js obtenus. Par ailleurs, le poids mol6culaire inf6rieur de la forme 2 pouvait sugg6rer son origine s partir de la forme 1 par dissociation du complexe bifonetionnel (DH Qase --SH.OI~ase).
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A.M. Boudet et al.
J
o.
i
10
20
30
10
20
.9
30 Fractions
Fig. 2a. Diagramme d'61ution des activit6s DHQase et SH.ORase sur hydroxylapatite. Colonne 1 x 10 era, 6quilibr6e darts du tampon phosphate M/200 de pH 6,8. Elution par un gradient lin6aire (300 ml tampon d'6quilibration--300 ml tampon phosphate M/6 de pH 6,8). Vitesse d'61ution 60 ml/h Fractions de 8 ml 2b. Les fractions correspondant s la zone hachur6e ont 6t6 lyophilis6es, "dessal6es" sur Sephadex G 25 puis chromatographi6es s nouveau sur hydroxylapatite dans les m~mes conditions Pour v4rifier ce point important nous avons r6p4t4 sur la forme 1 isol4e apr~s s4paration sur cellulose ou hydroxylapatite une chromatographic de l'enzyme sur ees m6me supports - - apr6s sa lyophilisation et un "dessalage" sur Sephadex G 25, - - apr6s lui avoir fair subir l'ensemble des traitements (extraction, pr6cipitation au sulfate d'ammonium) retcnus pour la pr4paration de l'extrait brut. Dans les deux cas on ne constate aucune apparition de la forme 2. La figure 2 b illustre cc type d'exp4rience dans le cas de la chromatographic sur hydroxy-
lapatite. Ces r4sultats, la raise en 4vidence de ces formes multiples par plusieurs techniques, leur pr4sence dans les diff6rents organes du vgg6tal, scutellum, racines, parties adricnnes, apportent de s6rieux arguments en faveur de la r~ellc existence i n vivo de deux D H Qase chez Zea mays. L'4tude des propri4t4s des deux formes de la D H Qase a 6t4 r4alisde sur les deux prot4ines enzymatiques obtenues apr6s s@aration sur colonne de DEAEcellulose. I1 faut rioter que contrairement aux isoenzymes classiques nous eomparons ici deux formes isofonctionneIles dont l'une est associde avec une autre enzyme, cette association pouvant avoir une influence sur certaines de ses propridt4s. Masse moldculaire. D'apr6s lcur comportcment sur Scphadex G 100 et par r~fdrence ~ droite une 4tablie avec des prot4ines marqueurs (albumine 67 000, ovalbumine 45000, cytochrome c 12400) les masses molaires respectives des formes 1 et 2 seraient de 55000 et 49000 (Fig. 3). K m . L'affinit4 pour le s u b s t r a t a 4t4 mesur4e ~ pH 7,5 dans le tampon phosphate mono K-diK 0,1 M. Dans ces conditions et s ce stade de purification les defix formes fonctionnent selon un m4canisme micha41ien. Les valcurs de K m d4termin4es selon Lineweavcr et Burk sont respectivement de 120.10-e M pour la forme 1 et de 80.10 -e M pour la forme 2.
Deux formes de la 5-d6shydroquinate hydro-lyase
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t DHQase 2
,-I ALBUMINE$
DHQasel
q
3'0
4LO
OVALBUMINE
8
[
20"0-
10
20
25J0 Effluent(ml)
Fig. 3. Diagramme d'61ution des activit6s DttQase et Stt.ORase sur Sephadex G 100 (les deux formes obtenues apr~s DEAE cellusose sont chromatographi6es s6par6ment). Colonne 3,5 • 45 em, 6quilibr6e darts du tampon phosphate M/100 de ph 7,5. Vitesse d'61ution 30 ml/h
9 9 forme 1 z~ ,~forme 2
"2
9 ~ forme 1 ~ forme 2
'2
100
Temps (heures)
Fig. 4. Effet du pH sur l'activit6 des deux formes de la DHQase (tampon phosphate mono K-di K 0,i M) Fig. 5. Stabilit6 thermique des deux formes de la DHQase. L'enzyme est maintenue a 30~ pendant des temps variables (abcisses) avant la mesure d'aetivit6
pH. Dans les deux cas on observe une activit6 maximale darts une m6me zone de pH allant de 6,5 & 8. Un comportement simflaire a 6t6 observ6 pour l'enzyme du Chou-fleur (Balinsky et Davies, 1961), du Bambou (Higuchi et Shimada, 1967) et du Ch@ne (Boudet, 1972), seuls v6g6taux ehez lesquels ces propri6t6s ont 6t6 d6termin6es. Chez le Mais cette absence d'optimum bien marqu6 eonstitue une caract6ristique commune des deux formes (Fig. 4). Stabilitd. La stabilit6 des deux formes diff6re consid6rablement lors de leur maintien & 30 ~ ~ pH 7,5. La forme 1 conserve pratiquement toute son activit6 au tours d'une p6riode de 4 h alors que la forme 2 perd dans les m8mes conditions envivon 50 % de son activit6 (Fig. 5). E n revanche les deux formes sont stables pendant plus d'une semaine k --25~
A. )5. Boudet et al.
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Tableau 1. Action de diff6rents effecteurs sur l'aetivit6 des deux formes de la DtiQase chez Zea mays. Les r6sultats sont exprim6s cn % do l'activit6 d'un essai sans effecteur, l'effecteur est ajout6 au temps 0 de la r6action Effecteurs Cone. dans lc milieu r6aetionnel
Forme I
Forme II
Acide quinique 2.10 -~ M 5" 10-a )5 1.10 -3 M
105 105 105
100 105 100
Acide protocat6chique 2" 10-~ M 5" 10-~ M
100 60
100 70
Acide shikimique 2.10 -~ M 5.10 -a M 1.10 -3 M
97 100 108
168 252 277
Rdgulation de l'activitd ~>invitro((. Ces deux enzymes p o u v a n t intervenir dans des voies parall61es nous avons rechereh6 si leur activit6 6tait sp6cifiquement modifi6e par des compos6s reli6s m6taboliquement ~ la r6action 6tudi6e (Tableau 1). L'acide quinique n'exerce pas d'effet signifieatif mais l'acide protocat6chique se r6v61e un inhibiteur e o m m u n des deux formes r6duisant d'environ 40% l'aetivit6 s la concentration de 5.10 -4 M. Ce dernier compos6, interm6diaire dans la voie catabolique du quinate chez les mieroorganismes, exer~e une puissante inhibition eomp6titive sur la D H Q a s e non associ6e au complexe chez Aspergillus niger (Cain, 1972). Chez les v6g6taux sup6rieurs il pourrait ~tre 6galement synth6tis6 par l'interm6diaire de la forme 2, mais les r6sultats obtenus ne permettent pas de conclure ~ une r6troinhibition particuli6re de cette forme, ce qui aurait pu confirmer ee point de vue. I1 f a u t cependant souligner ici l'effect inhibiteur g6n6ral des acides ph6noliques sur les enzymes qui pourrait masquer une action sp6eifique. L'acide shikimique pour sa p a r t qui d6rive de l'action du complexe bifonctionnel ne d6termine aucune modification notable de l'activit6 de la forme 1. E n revanche il stimule eonsid6rablement la forme 2 dont l'activit6 est presque tripl6e en pr6sence de l'effecteur. Cette r6gulation sp6eifique de l'une des deux D H Qase diff6rencie ~ nouveau cos deux formes et eonfirme leur r6alit6 in vivo. Discussion Les rSsultats pr~c6dents constituent ~ notre connaissance la premiere mise en 6vidence de ~ormes multiples de la D H Qase ehez les v~g6taux sup6rieurs. Zea mays poss~de deux formes constitutives de la D H Qase l'une associ6e s la SIt.ORase et l'autre libre. Cette situation diff~re de celle rencontrde ehez divers mieroorganismes chez lesquels la forme libre n'est pas d~eelge dans les conditions normales mais est seulement inductible en prdsence d'aeides alieycliques. Chez u n parasite du Mai's, Ustilago maydis, la forme libre a cependant ~t6 signalge
Deux formes de la 5-deshydroquinate hydro-lyase
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l'6tat constitutif, cette caract6ristique 6rant associ6e s la pr6sence d'acide quinique dans la composition du v6g~tal h6te. Chez les plantes sup6rieures le curact~re constitutif de cettc deuxi~me forme pourrait ~tre reli6 s la presence naturelle d'ucide quinique si r o n admet l'intervention de la DHQase 2 duns le catabolisme du quinate. Les deux formes pr6sentent des analogies au niveau de leur pH optimum et de leur affinit6 pour le substrat. Chez A. niger Cain (1972) signule un K m de 46 ~M pour la forme ussoci6e au complexe et 420 ~M pour l'isoenzyme libre. Cette difference peut 6tre reli6e au fair que cette derni6re est seulement fonctionnelle en pr6sence de quantit6 importante de son substrat qui joue le rSle d'inducteur. Les vuleurs obtenues chez le Mais montrent au contraire que les deux formes sont attires pour des concentrations voisines en acide 5-ddshydroquinique, ce qui sugg6re leur fonctionnement parall6le et s'accorde avec leur caract~re constitutif. Les deux D H Qase se distinguent par leur stabilit6 thermique, la forme libre se r~v4lant la plus labile s l'inverse du comportement coustat6 chez Neurospora crassa (Giles et al., 1967). Chez ce champignon en effet la forme induite est thermostablc, la forme constitutive facilement d6natur6e par la chaleur. Mais l'une des diff6rences les plus marquantes r6side duns l'importante activation de la forme libre par l'acide shikimique qui n'avait pus 6t~ signal6e auparavant. Cet exemple d'activation par un m6tabolite effecteur s'ajoute uux cas peu nombreux d'interactions r6gulatrices positives caruct6ris6es jusqu's pr6sent chez les v6g6taux supgrieurs (Preiss et Kosuge, 1970). I1 est s rapproeher de l'effet activateur du tryptophane sur lu chorismate mutase mis en ~vidence sur le m~me axe mgtabolique (Gadal et Bouyssou, 1973). Au-dels de ce ph6nom~ne d'activation au sens strict qui demande unc 6rude plus upprofondie on peut envisager les avuntages d'un tel systbme. Des isoenzymes ~ activit6 diff6remment r6gul6e out 6t6 mentionn6es s diverses reprises, en particulier chez les microorganismes (Gibson et Pittard, 1968) et cette caract6ristique essentielle dans la r6gulation des chulnes m6tuboliques branch6es (Stadtman, 1968), est considdr6e comme une preuve de leur int4r6t physiologique. Cependant, ce contrSle sp6cifique de formes isoenzymatiques par diff6rents produits finaux n'exerce une action r6ellement efficace qu'assoei6 ~ des m6canismes compl6mentaires: - - r6troinhibition simultan~e d'une isoenzyme et du biocutulyseur directement l'origine de son effecteur spgcifique (syst6me D A H P synth6tase - - pr4ph6nate d6shydrog~nase, pr6ph6nate d4shydratase chez Claviceps paspali (Lingens et al., 1967) - - c o m p a r t i m e n t a t i o n au niveau cellulaire des isoenzymes (syst~me PAL chez Quercus, Alibert et al., 1972) compartimentation au niveau mol4culaire des produits form6s sous Faction de chaque isoenzyme par l'interm6diaire de complexes enzymatiques. Duns ce dernier cas nous pouvons ~tre en prdsence de deux situations distinetes. Une des formes de l'enzyme est iatggr~e duns un complexe multifonctionnel comportant des ~tapes enzymatiques en amont et en aval de la r~action qu'elle catalyse. Les deux formes utflisent alors en fair des pools distincts de substrat (vole biosynth6tique de l'acide shikimique et voie cutabolique du quinate chez Neurospora crassa (Ahmed et Giles, 1969). -
-
74
A . M . B o u d o t et al.
Une des isoenzymes fair partie d'un complexe d6butant au niveau de la r6action catalys6e, dans ce eas les deux formes peuvent utiliser un pool commun de substrat et c'est leur aetivit~ relative qui orientera son utilisation, le produit de la r6aetion de ehaque forme ayant un devenir m6tabolique distinct en raison du ph4nom6ne de (~channeling~>. La situation relevfie chez le Mais eorrespondrait ~ eette derni6re possibilit6. Les deux isoenzymes pourraient ~tre loealis6es dans le m6me compartiment cellulaire et utiliser un pool commun d'acide 5-DttQ. Le produit de la forme 1 non lib~r6 dans le milieu serait ((eanalisd~> antomatiquement vers la vole de l'aeide shikimique et en revanche l'acide 5-DHS provenant de la forme 2 pourrait 6tre utilisd sp6cifiquement pour la production d'aeide protoeat6chique. Quand l'aeide shikimique deviendrait trop abondant dans la cellule fl aetiverait la DHQase 2 et ce contr61e permettrait d'assurer la distribution dquilibr6e de l'acide 5-DHQ entre les deux voles mgtaboliques utilisant ce pr6curseur commun. Ac. quinique
Oses
~DAHP
?
.......... ~DHQ
DH Qase 2
)DHS
DHS
> D H Q]
DHQase 1
?
..........
Ac. protocat6chique
~ Ac. shikimique SH.ORase
Aeides amin6s aromatiques Ce type de m6canisme qui n'avait encore jamais 6t6 d6erit ehez les v6g6taux sup6rieurs pr6sente des analogies 6videntes avec le systbme mis en 6vidence par Davis (1967) chez ~eurospora et par Lue et Kaplan (1970--1971) chez la Levure qui comprend deux carbamyl phosphate synth6tases diff6remment r6gul6es dont l'une est associ6e avec l'aspartate transcarbamylase. Dans les deux cas la pr6senee d'un complexe permettrait une s6gr6gation du produit eommun de Faction de deux isoenzymes et la r6gulation sp6cifique de l'une des formes (inhibition chez la Levure ou activation chez le Mais) n'affecterait que l'une de ses voles d'utflisation. Les r6sultats obtenus ehez le Mais, semblent donc d6montrer la g6n6ralit6 d'un m6canisme fondamental dans le contr61e du m6tabolisme cellulaire qui assoeie isoenzymes diff~remment r6gul~es et complexe enzymatique ~ effet de canalisation. Nous pensons maintenant eonfirmer ces interpretations en recherehant en partieulier l'intervention sp6eifique de la DHQase 2 dans l'utilisation de l'acide quinique constituant naturel des v~gdtaux et dans la synthbse de l'acide protocat~ehique.
Deux formes de la 5-d~shydroquinate hydro-lyase
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Mise en 6vidence et propri6t6s de deux formes de la 5-d6shydroquinate hydro-lyase chez les v6g6taux sup6rieurs* Alain M. Boudet, l~aymond L6cussan et Annie B o u d e t Enzymologie et M6tabolisme, Equipe de Recherche associ6e au CNRS, Universit6 Paul Sabatier-Centre de Physiologic V6g6tale, 118, route de Narbonne, F-31077 Toulase C6dex, France Regu le 16 janvier; acept6 le 10 f6vricr 1975 Characterization and Properties of Two D e h y d r o q u i n a t e H y d r o - L y a s e s in Higher Plants Summary. Two dehydroquinate hydro-lyases (E.C. 4.2.1.10) have been routinely separated from different organs of Zea mays L. by chromatography on Cellex-D Bio-Rad or hydroxypatite using linear salt gradients. Dehydroquinate hydro-lyase 1 is associated with shikimate: NADP + oxidoreductase (E.C. 1.1.1.25). DHQase 2 is a free constitutive enzyme; in this respect it differs from the inducible enzyme of microorganisms which appears only when dehydroquinate or quinate is the principal carbon source. DHQase 1 and DHQase 2 have a similar apparent Michaelis constant and pH optimum, but they differ in their molecular weight, thermal stability and sensitivity to metabolic effectors. DHQase 2 is specifically activated by shikimie acid. This strong activation and the channeling properties of the complex involved in the shikimate pathway can provide an effective means of control in the utilization of dehydroquinate between two different pathways. The significance of such a system involving both a specific regulation of isoenzymes and a molecular compartmentation by means of an enzymatic complex is discussed.
Introduction Chez les v6g6taux sup6rieurs la synth6se des acides amin6s aromatiques fair intervenir, comme chez les microorganismes, la voie de l'acide shikimique. Nous avons r6cemment montr6 que deux enzymes de cette s6quence m6tabolique la 5-d6shydroquinate hydro-lyase (E.C. 4.2.1.10) et la shikimate: I~ADP + oxydor6ductase (E.C. 1.1.1.25) 6taient associ6es chez les plantes sous forme d ' u n complexe vraisemblablement bifonctionnel (Boudet et L6eussan, 1974). Cette situation diff6re de celle constat6e chez terrains champignons qui poss6dent 5 activit6s (6tapes 2 ~ 6, sch6ma) r6unies au sein d ' u n complexe multifonctionnel (Ahmed et Giles, 1969) ou, ehez les Procaryotes pour lesquels on ne rel6ve aucune association (Berlyn et al., 1970). E n dehors de l'efficacit6 accrue due au r a p p r o c h e m e n t spatial d'enzymes op6rant s6quentiellement ees complexes p e u v e n t faciliter la r6gulation du m6tabolisme par un effet de c o m p a r t i m e n t a t i o n au niveau mol6culaire (" channeling") d'intermddiaires communs ~ plusieurs ehalnes m6taboliques. C'est le cas pour * Abrgviations: 5-d6shydroquinate hydro-lyase = DHQase; Shikimate: NADP + oxydor6ductase = SIt. ORase; Aeide 5-d6shydrosbikimique = 5-DHS; Acide 5-d6shydroquinique = 5-DHQ. 5*
68
A.M. Boudet et al. Sch6ma
D-Erythrose 4-phosphate
AC.
quiaique > Ac. 3-desoxy-D. arabinoheptulosonique 7-phosphate
I Phospho6nolpyruvate
>
Ac. 5-d6shydro* quinique Ac.
5-d6shydroquinique Ae. 5-d6shydroshikimique 4
Ac. choris- < mique
Ac. 6nol. < pyruvylshikimique 5-phosphate
5
6
-~e.
acide protocat6chique (Tateoka, 1968; Marigo et al., 1969) et l~ presence du complexe bifonctionnel d6jh mentionn6 qui devrait "canaliser" l'acide D H S vers la synth~se d'acide shikimique nous ont conduits s rechercher l'existence de formes multiples de la DH Qase chez les v6g6taux sup6rieurs.
Mat6riel et m6thodes Matdrid. Les d6termin~tions portent sur diff6rents organes de Zea maya L. (var. INRA
400): seutellums d6taeh6s apr~s imbibition des semences pendant 36 h dans l'eau distill6e, parties a~riennes ou raeines pr61ev~es sur des plants de 1 ~ 2 semaines obtenus en salle conditionn6e (5000 lux, photop4riode 14 h, 25~ vermiculite arros6e de milieu de Hoagland Arnon formule C 1). Mdthodes. L'origine des substrats de r6action et les protocoles de mesure des activit6s DH Qase et SH.ORase ont d6j~ 6t6 pr6eis~s (Boudet, 1971). L'activit6 DHQase est g4n6ralement appr6ci6e pour des temps d'action de 10 ~ 15 rain pour lesquels ]~ r~action demeure d'ordre nul. Pour l'obtention de l'extrait enzymatique brut, le materiel frais (ou congel6) broy~ au
Deux formes de la 5-d6shydroquinate hydro-lyase
69
11:
if1 i
Ii lO
I
T
I
I
20
31]
411
50
60
71]Fraction s
Fig. 1. Diagramme d'61ution des activit6s DH Qase et SH.ORase sur DEAE cellulose. Colonne 1 • 15 era, 6quilibr6e dans du tampon phosphate M/100 de pH 7,5. Elution par un gradient lingaire (300 ml tampon d'6quilibration --300 ml tampon phosphate M/5 de pH 7,5). Vitesse d'61ution 60 ml/h Fractions de 6 ml
mortier en pr6sence d'azote liquide est homog6n6is6 dans 5 volumes de tampon phosphate pit 7,5 0,1 M contenant 0,2% de mcrcapto6thanol v/v (Ultra Turrax). Apr~s centrifugation 15 rain s 20000g les prot6ines du surnageant sont pr6cipit6es en amenant la concentration en sulfate d'ammonium ~ 70%. Le culot de centrifugation obtenu est repris par le minimum de tampon d'extraction puis chromatographi6 directement sur Sephadex G 100 ou "dessal6" sur Sephadex G 25. La recherche des formes multiples de la DHQase a mis en jeu plusieurs m6thodes de s6paration des enzymes faisant appel s des propri6t6s diff6rentes des mol6cules prot6iques: filtration sur gel de Sephadex G 100, chromatographie sur DEAE cellulose (cellex-D Bio Rad) et sur hydroxylapatite (Biogel HTP Bio-Rad).
R~sultats AprSs filtration de l'extrait brut sur gel de Sephadex G 100 l'activit~ D H Qase est 61uge selon deux pics principaux, l'activit6 SH.ORase 6rant pr~sente au niveau du premier pic. Une chromatographie sur DEAE-cellulose conduit & une meilleure s6paration des deux formes (Fig. 1) qui existent en proportions comparables. On convient d'appeler DHQase 1 la premi6re forme 61u6e avec la SIt.ORase D t I Quase 2 la deuxibme forme, ind6pendante. Une s6paration peut ~tre 6galement obtenue par chromatographie sur hydroxylapatite mais dans ce cas l'ordre d'61ution des deux formes est invers6 (Fig. 2a). Afin d'appr6cier d'6ventuels artefacts au niveau de l'extraction celle-ci a 6t6 r6alisge selon diff6rents protocoles: homog~ngisation dans du tampon phosphate uniquement ou duns le tampon du protocole g6n6ral contenant divers protecteurs poly6thyl6ne glycol 20000 ~ 0,5%, ph6nylmgthylsulfonyl fluoride (inhibiteur des prot6ases) 0,1 mM, glycgrol s 10%. On ne eonstate dans ces conditions aucune modification des r6sultats d6js obtenus. Par ailleurs, le poids mol6culaire inf6rieur de la forme 2 pouvait sugg6rer son origine s partir de la forme 1 par dissociation du complexe bifonetionnel (DH Qase --SH.OI~ase).
70
A.M. Boudet et al.
J
o.
i
10
20
30
10
20
.9
30 Fractions
Fig. 2a. Diagramme d'61ution des activit6s DHQase et SH.ORase sur hydroxylapatite. Colonne 1 x 10 era, 6quilibr6e darts du tampon phosphate M/200 de pH 6,8. Elution par un gradient lin6aire (300 ml tampon d'6quilibration--300 ml tampon phosphate M/6 de pH 6,8). Vitesse d'61ution 60 ml/h Fractions de 8 ml 2b. Les fractions correspondant s la zone hachur6e ont 6t6 lyophilis6es, "dessal6es" sur Sephadex G 25 puis chromatographi6es s nouveau sur hydroxylapatite dans les m~mes conditions Pour v4rifier ce point important nous avons r6p4t4 sur la forme 1 isol4e apr~s s4paration sur cellulose ou hydroxylapatite une chromatographic de l'enzyme sur ees m6me supports - - apr6s sa lyophilisation et un "dessalage" sur Sephadex G 25, - - apr6s lui avoir fair subir l'ensemble des traitements (extraction, pr6cipitation au sulfate d'ammonium) retcnus pour la pr4paration de l'extrait brut. Dans les deux cas on ne constate aucune apparition de la forme 2. La figure 2 b illustre cc type d'exp4rience dans le cas de la chromatographic sur hydroxy-
lapatite. Ces r4sultats, la raise en 4vidence de ces formes multiples par plusieurs techniques, leur pr4sence dans les diff6rents organes du vgg6tal, scutellum, racines, parties adricnnes, apportent de s6rieux arguments en faveur de la r~ellc existence i n vivo de deux D H Qase chez Zea mays. L'4tude des propri4t4s des deux formes de la D H Qase a 6t4 r4alisde sur les deux prot4ines enzymatiques obtenues apr6s s@aration sur colonne de DEAEcellulose. I1 faut rioter que contrairement aux isoenzymes classiques nous eomparons ici deux formes isofonctionneIles dont l'une est associde avec une autre enzyme, cette association pouvant avoir une influence sur certaines de ses propridt4s. Masse moldculaire. D'apr6s lcur comportcment sur Scphadex G 100 et par r~fdrence ~ droite une 4tablie avec des prot4ines marqueurs (albumine 67 000, ovalbumine 45000, cytochrome c 12400) les masses molaires respectives des formes 1 et 2 seraient de 55000 et 49000 (Fig. 3). K m . L'affinit4 pour le s u b s t r a t a 4t4 mesur4e ~ pH 7,5 dans le tampon phosphate mono K-diK 0,1 M. Dans ces conditions et s ce stade de purification les defix formes fonctionnent selon un m4canisme micha41ien. Les valcurs de K m d4termin4es selon Lineweavcr et Burk sont respectivement de 120.10-e M pour la forme 1 et de 80.10 -e M pour la forme 2.
Deux formes de la 5-d6shydroquinate hydro-lyase
71
t DHQase 2
,-I ALBUMINE$
DHQasel
q
3'0
4LO
OVALBUMINE
8
[
20"0-
10
20
25J0 Effluent(ml)
Fig. 3. Diagramme d'61ution des activit6s DttQase et Stt.ORase sur Sephadex G 100 (les deux formes obtenues apr~s DEAE cellusose sont chromatographi6es s6par6ment). Colonne 3,5 • 45 em, 6quilibr6e darts du tampon phosphate M/100 de ph 7,5. Vitesse d'61ution 30 ml/h
9 9 forme 1 z~ ,~forme 2
"2
9 ~ forme 1 ~ forme 2
'2
100
Temps (heures)
Fig. 4. Effet du pH sur l'activit6 des deux formes de la DHQase (tampon phosphate mono K-di K 0,i M) Fig. 5. Stabilit6 thermique des deux formes de la DHQase. L'enzyme est maintenue a 30~ pendant des temps variables (abcisses) avant la mesure d'aetivit6
pH. Dans les deux cas on observe une activit6 maximale darts une m6me zone de pH allant de 6,5 & 8. Un comportement simflaire a 6t6 observ6 pour l'enzyme du Chou-fleur (Balinsky et Davies, 1961), du Bambou (Higuchi et Shimada, 1967) et du Ch@ne (Boudet, 1972), seuls v6g6taux ehez lesquels ces propri6t6s ont 6t6 d6termin6es. Chez le Mais cette absence d'optimum bien marqu6 eonstitue une caract6ristique commune des deux formes (Fig. 4). Stabilitd. La stabilit6 des deux formes diff6re consid6rablement lors de leur maintien & 30 ~ ~ pH 7,5. La forme 1 conserve pratiquement toute son activit6 au tours d'une p6riode de 4 h alors que la forme 2 perd dans les m8mes conditions envivon 50 % de son activit6 (Fig. 5). E n revanche les deux formes sont stables pendant plus d'une semaine k --25~
A. )5. Boudet et al.
72
Tableau 1. Action de diff6rents effecteurs sur l'aetivit6 des deux formes de la DtiQase chez Zea mays. Les r6sultats sont exprim6s cn % do l'activit6 d'un essai sans effecteur, l'effecteur est ajout6 au temps 0 de la r6action Effecteurs Cone. dans lc milieu r6aetionnel
Forme I
Forme II
Acide quinique 2.10 -~ M 5" 10-a )5 1.10 -3 M
105 105 105
100 105 100
Acide protocat6chique 2" 10-~ M 5" 10-~ M
100 60
100 70
Acide shikimique 2.10 -~ M 5.10 -a M 1.10 -3 M
97 100 108
168 252 277
Rdgulation de l'activitd ~>invitro((. Ces deux enzymes p o u v a n t intervenir dans des voies parall61es nous avons rechereh6 si leur activit6 6tait sp6cifiquement modifi6e par des compos6s reli6s m6taboliquement ~ la r6action 6tudi6e (Tableau 1). L'acide quinique n'exerce pas d'effet signifieatif mais l'acide protocat6chique se r6v61e un inhibiteur e o m m u n des deux formes r6duisant d'environ 40% l'aetivit6 s la concentration de 5.10 -4 M. Ce dernier compos6, interm6diaire dans la voie catabolique du quinate chez les mieroorganismes, exer~e une puissante inhibition eomp6titive sur la D H Q a s e non associ6e au complexe chez Aspergillus niger (Cain, 1972). Chez les v6g6taux sup6rieurs il pourrait ~tre 6galement synth6tis6 par l'interm6diaire de la forme 2, mais les r6sultats obtenus ne permettent pas de conclure ~ une r6troinhibition particuli6re de cette forme, ce qui aurait pu confirmer ee point de vue. I1 f a u t cependant souligner ici l'effect inhibiteur g6n6ral des acides ph6noliques sur les enzymes qui pourrait masquer une action sp6eifique. L'acide shikimique pour sa p a r t qui d6rive de l'action du complexe bifonctionnel ne d6termine aucune modification notable de l'activit6 de la forme 1. E n revanche il stimule eonsid6rablement la forme 2 dont l'activit6 est presque tripl6e en pr6sence de l'effecteur. Cette r6gulation sp6eifique de l'une des deux D H Qase diff6rencie ~ nouveau cos deux formes et eonfirme leur r6alit6 in vivo. Discussion Les rSsultats pr~c6dents constituent ~ notre connaissance la premiere mise en 6vidence de ~ormes multiples de la D H Qase ehez les v~g6taux sup6rieurs. Zea mays poss~de deux formes constitutives de la D H Qase l'une associ6e s la SIt.ORase et l'autre libre. Cette situation diff~re de celle rencontrde ehez divers mieroorganismes chez lesquels la forme libre n'est pas d~eelge dans les conditions normales mais est seulement inductible en prdsence d'aeides alieycliques. Chez u n parasite du Mai's, Ustilago maydis, la forme libre a cependant ~t6 signalge
Deux formes de la 5-deshydroquinate hydro-lyase
73
l'6tat constitutif, cette caract6ristique 6rant associ6e s la pr6sence d'acide quinique dans la composition du v6g~tal h6te. Chez les plantes sup6rieures le curact~re constitutif de cettc deuxi~me forme pourrait ~tre reli6 s la presence naturelle d'ucide quinique si r o n admet l'intervention de la DHQase 2 duns le catabolisme du quinate. Les deux formes pr6sentent des analogies au niveau de leur pH optimum et de leur affinit6 pour le substrat. Chez A. niger Cain (1972) signule un K m de 46 ~M pour la forme ussoci6e au complexe et 420 ~M pour l'isoenzyme libre. Cette difference peut 6tre reli6e au fair que cette derni6re est seulement fonctionnelle en pr6sence de quantit6 importante de son substrat qui joue le rSle d'inducteur. Les vuleurs obtenues chez le Mais montrent au contraire que les deux formes sont attires pour des concentrations voisines en acide 5-ddshydroquinique, ce qui sugg6re leur fonctionnement parall6le et s'accorde avec leur caract~re constitutif. Les deux D H Qase se distinguent par leur stabilit6 thermique, la forme libre se r~v4lant la plus labile s l'inverse du comportement coustat6 chez Neurospora crassa (Giles et al., 1967). Chez ce champignon en effet la forme induite est thermostablc, la forme constitutive facilement d6natur6e par la chaleur. Mais l'une des diff6rences les plus marquantes r6side duns l'importante activation de la forme libre par l'acide shikimique qui n'avait pus 6t~ signal6e auparavant. Cet exemple d'activation par un m6tabolite effecteur s'ajoute uux cas peu nombreux d'interactions r6gulatrices positives caruct6ris6es jusqu's pr6sent chez les v6g6taux supgrieurs (Preiss et Kosuge, 1970). I1 est s rapproeher de l'effet activateur du tryptophane sur lu chorismate mutase mis en ~vidence sur le m~me axe mgtabolique (Gadal et Bouyssou, 1973). Au-dels de ce ph6nom~ne d'activation au sens strict qui demande unc 6rude plus upprofondie on peut envisager les avuntages d'un tel systbme. Des isoenzymes ~ activit6 diff6remment r6gul6e out 6t6 mentionn6es s diverses reprises, en particulier chez les microorganismes (Gibson et Pittard, 1968) et cette caract6ristique essentielle dans la r6gulation des chulnes m6tuboliques branch6es (Stadtman, 1968), est considdr6e comme une preuve de leur int4r6t physiologique. Cependant, ce contrSle sp6cifique de formes isoenzymatiques par diff6rents produits finaux n'exerce une action r6ellement efficace qu'assoei6 ~ des m6canismes compl6mentaires: - - r6troinhibition simultan~e d'une isoenzyme et du biocutulyseur directement l'origine de son effecteur spgcifique (syst6me D A H P synth6tase - - pr4ph6nate d6shydrog~nase, pr6ph6nate d4shydratase chez Claviceps paspali (Lingens et al., 1967) - - c o m p a r t i m e n t a t i o n au niveau cellulaire des isoenzymes (syst~me PAL chez Quercus, Alibert et al., 1972) compartimentation au niveau mol4culaire des produits form6s sous Faction de chaque isoenzyme par l'interm6diaire de complexes enzymatiques. Duns ce dernier cas nous pouvons ~tre en prdsence de deux situations distinetes. Une des formes de l'enzyme est iatggr~e duns un complexe multifonctionnel comportant des ~tapes enzymatiques en amont et en aval de la r~action qu'elle catalyse. Les deux formes utflisent alors en fair des pools distincts de substrat (vole biosynth6tique de l'acide shikimique et voie cutabolique du quinate chez Neurospora crassa (Ahmed et Giles, 1969). -
-
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A . M . B o u d o t et al.
Une des isoenzymes fair partie d'un complexe d6butant au niveau de la r6action catalys6e, dans ce eas les deux formes peuvent utiliser un pool commun de substrat et c'est leur aetivit~ relative qui orientera son utilisation, le produit de la r6aetion de ehaque forme ayant un devenir m6tabolique distinct en raison du ph4nom6ne de (~channeling~>. La situation relevfie chez le Mais eorrespondrait ~ eette derni6re possibilit6. Les deux isoenzymes pourraient ~tre loealis6es dans le m6me compartiment cellulaire et utiliser un pool commun d'acide 5-DttQ. Le produit de la forme 1 non lib~r6 dans le milieu serait ((eanalisd~> antomatiquement vers la vole de l'aeide shikimique et en revanche l'acide 5-DHS provenant de la forme 2 pourrait 6tre utilisd sp6cifiquement pour la production d'aeide protoeat6chique. Quand l'aeide shikimique deviendrait trop abondant dans la cellule fl aetiverait la DHQase 2 et ce contr61e permettrait d'assurer la distribution dquilibr6e de l'acide 5-DHQ entre les deux voles mgtaboliques utilisant ce pr6curseur commun. Ac. quinique
Oses
~DAHP
?
.......... ~DHQ
DH Qase 2
)DHS
DHS
> D H Q]
DHQase 1
?
..........
Ac. protocat6chique
~ Ac. shikimique SH.ORase
Aeides amin6s aromatiques Ce type de m6canisme qui n'avait encore jamais 6t6 d6erit ehez les v6g6taux sup6rieurs pr6sente des analogies 6videntes avec le systbme mis en 6vidence par Davis (1967) chez ~eurospora et par Lue et Kaplan (1970--1971) chez la Levure qui comprend deux carbamyl phosphate synth6tases diff6remment r6gul6es dont l'une est associ6e avec l'aspartate transcarbamylase. Dans les deux cas la pr6senee d'un complexe permettrait une s6gr6gation du produit eommun de Faction de deux isoenzymes et la r6gulation sp6cifique de l'une des formes (inhibition chez la Levure ou activation chez le Mais) n'affecterait que l'une de ses voles d'utflisation. Les r6sultats obtenus ehez le Mais, semblent donc d6montrer la g6n6ralit6 d'un m6canisme fondamental dans le contr61e du m6tabolisme cellulaire qui assoeie isoenzymes diff~remment r6gul~es et complexe enzymatique ~ effet de canalisation. Nous pensons maintenant eonfirmer ces interpretations en recherehant en partieulier l'intervention sp6eifique de la DHQase 2 dans l'utilisation de l'acide quinique constituant naturel des v~gdtaux et dans la synthbse de l'acide protocat~ehique.
Deux formes de la 5-d~shydroquinate hydro-lyase
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