Planta (Berl.) 72, 232--246 (1967)

DIE REGULATION DER RNS-SYNTHESE IN FARNGAMETOPHYTEN DURCIt LICHT HELGA DRVM~ u n d HANS Motto Botanisches Institut der Universit~t Freiburg i. Br. Eingegangen am 19. September 1966 THE REGULATION OF RNA SYNTHESIS IN FERN GAMETOPHYTES BY LIGHT Summary. 1VIorphogenesis and metabolism of the gametophytes ( = sporelings) of the common male fern Dryopteris/ilix-mas are controlled by visible radiation. Short wavelengths visible radiation ( = blue light) leads to an increase in protein synthesis and makes possible the formation of "normal" two-dimensional prothallia. Under long wavelengths visible radiation ( ~ red light) the sporelings grow as cellular filaments the protein contents of which are markedly lower than under blue irradiation even under conditions of equal rate of dry matter accumulation in red and blue (O~LENROTttand l~om% 1963). - - It is shown in the present paper that the RNA content of sporelings of the same age is always higher in blue light than in red light (Figs. 1, 3). The blue-dependent increase of RNA occurs faster than the blue-dependent increase of protein (Fig. 2). Furthermore the increase of protein per sporeling is much larger than the increase of RNA (Fig. 4). These facts are in agreement with the hypothesis that in some way or another blue light initiates differential gene activation. The blue light-dependent morphological changes which occur if we put red grown filamentous sporelings under blue light can be measured much faster than the blue light-dependent increase of the bulk protein (Figs. 5, 6). We have to conclude as we did in a previous paper (KAsv,~cmand Mort/t, 1965) that the blue lightdependent increase in the protein content of the sporelings might be mainly due to an increase of chloroplast protein. - - The blue light-dependent increase of the RNA content occurs at least as fast as the morphological changes (Figs. 5, 6). This finding is supplemented by the observation (Fig. 8) that blue light markedly and rapidly stimulates the incorporation of iaC into RNA. The iaC was applied as i4C-uridine (U). - - I t seems that blue light causes an increase of protein synthesis in the chloroplasts as well as in the cytoplasm. Blue light-dependent RNA synthesis seems to be involved in this response. These data support the view that blue light might exert its morphogenetic control through differential gene activation.

EinleiPang Die j u n g e n G a m e t o p h y t e n ( ~ Vorkeime) des W u r m f a r n s Dryopteri8 (L.) SCHOTT, der als R e p r / i s e n t a n t der l e p t o s p o r a n g i a t e n F a m e gelten k a n n , e n t w i c k e l n sich u n t e r natfirlichen L i e h t v e r h ~ l t n i s s e n n a c h der S p o r e n k e i m u n g rasch fiber das f~dige P r o t o n e m a z u m fls P r o t h a l l i u m . Diese ,,normale" E n t w i c k l u n g k a n n n u r v o n s t a t t e n gehen, w e n n der j u n g e G a m e t o p h y t gentigend kurzwellige siehtbare S t r a h l u n g

]ilix-mas

Die l~egula~ion der I~NS-Synthese in Farng~metophyten durch Licht

233

(,,Blaulicht") erh/~lt. Es handelt sich also um eine ,,obligate Photomorphogenese" (Mohr, 1 9 5 6 b ) . - Wit fragen naeh der Kausalit/~t dieser obligaten Photomorphogenese. Es konnte gezeigt werden ( M o ~ und O t l L ~ o T ~ , 1962), dal~ die Photosynthese bei der AuslSsung der blaulichtspezifisehen Morphogenese keine l~olle spielt. Welter konnte nachgewiesen werden ( S c I ~ N A ~ N B ~ G ] ~ , 1966), da$ die morphogenetisehe Wirkung des B]aulichts nicht auf das Phytoehrom zurfiekgeffihrt werden kann. Man mu$ vielmehr ein separates Photoreaktionssystem annehmen. Da die Photoreceptormolekfile wenigstens zum Teil in einer wandnahen diehroitischen Struktur angeordnet zu sein scheinen (ETzoL]), 1965), entfallen die Pigmente der Chloroplasten als mSgliche Kandidaten. Wir haben bislang keine zuverl/~ssige Information fiber die bioehemisehe Natur des Photoreeeptors und fiber die durch Blaulieht ausgelSste Photoreaktion. - - Die hypothetische Antwort, wie das Blau]ieht die Umsteuerung der Vorkeime yore f/~digen zum fl~ehigen Wachstum bewirken kann, mul~ demgem/~13 sehr formal gehalten werden. Wir stellen nns vor (vgl. Mon~, 1965), da$ die Absorption yon Blaulicht eine photochemisehe Reaktion auslSst, deren Produkt letztlieh bewirkt, da$ bestimmte Gent aktiviert werden, deren Funktion ffir die ,,normale", fl/~chige Morphogenese gebraueht wird. Wir gehen also davon aus, dab der blaulichtspezifischen Morphogenese die Bfldung spezifischer Enzyme zugrunde liegt. - - Wenn man die allgemein akzeptierte Vorstellung Gen-->I~NS--> Protein zugrunde legt, ist zu erwarten, da~ das Blaulieht ~nderungen im RNS- Stoffwechsel verursacht. - - Wir beriehten in der vorliegenden Arbeit fiber J~_nderungen der l~NS-Netto-Synthese, die auf Blaulicht zurfickzuffihren sind. Im Diskussionsteil wird dann das Problem zu behandeln sein, ob die durch Blaulicht bewirkten ~nderungen der RNS-Netto-Synthese im Sinn der obigen Hypothese in eine kausale Beziehung zu der blaulichtspezifischen Morphogenese gebracht werden kSnnen. Bei der Untersuchung der Proteinsynthese haben wir n~mlieh die Erfahrung gemacht (KAs~Mm und M o ~ , 1965), dal~ zumindest der grS~te Teil des unter dem Einflul~ yon Blaulicht in den Farngametophyten zus~ttzlich entstandenen Proteins nicht in eine unmittelbare kausale Beziehnng zu den morphogenetisehen Vers gebracht werden kann. Dieses ,,Blaulichtprotein" ist vielmehr bevorzugt in den Chloroplasten lokalisiert (BE~F~LI), 1964 ; KAS]~M~ und Mon~, 1965). Material mad Methoden

1. Material ])as verwendete Sporenmateria] yon Dryopteris filix-mas (L.) Sct[oTT wurde 1962 im Botanischen Garten in Tiibingen gesammelt, sorgfiil~ig yon Sporangienresten gereinigt und bis zur Verwendung bei 4---6~ aufbewahrt.

234

H. DBUMMund H. MOOR:

2. Allgemeiner Versuehsansatz a) Ngghrl68ung. Vgl. Mon~ und O~LE~OT~, 1962; Ausgangs-pH: 6,1 ~=0,1. b) Aussaat und Vorbehandlung der Sporen. Jeweils 401 bzw. 501 ml NiihrlSsung werden in Kulturschalen von 8 em Durchmesser und 5 cm HShe einpipettiert. Die Sporen werden mit einem Hohlmal~, dessen FassungsvermSgen 4,1 =L0,06 mg betr~gt, auf die Oberfl~che der N~hrlSsung ausgestreut. Ein locker aufgelegter Glasdeckel erlaub% eine ungehinderte C02-Diffusion w~hrend der Dauer der Anzueht (PxYE~, unverSffentlichte Daten). Die ,,Vorbehandlung" der ausges~ten Sporen besteht aus drei Phasen: zun~ehs~ werden die Kulturen 48 Std im Dunkeln gehalten. W~hrend dieser Zeit quellen die Sporen, und es entsteht eine gleichm~l~ige Lich%empfindliehkeit. Die Keiminduktion erfolgt dureh eine zweitiigige Hellrot. bes%rahlung ()5om~, 1956a). Um eine mSglichst synehrone Keimung zu erzielen, werden die Schalen jetzt nochmals 48 Std ins Dunkle gestellt. Naeh Abschlul~ dieser sechst~gigen Vorbehandlung ist der Zustand der ,,Keimung" erreieht, und die Experimente in den Standardfeldern ffir Hellrot ~ (HR) und Blau]icht ~ (BL) kSnnen beginnen.

3. Bestrahlungsanlagen Alle Versuche werden im Dauerlieht in den Standardleldern ffir HR und BL des hiesigen Instituts (Mon~ u. Mitarb., 1964) durehgeffihrt. Die Temperatur der Tisehplatte, auf der die Kulturschalen stehen, betr~gt 20 • 0,5~ Der COs-Partialdruck in der Umgebung der Schalen kann als arm~hernd konstant angesehen werden. Die Strahlungsfelder sind auf ann~hernd gleiehe Quantenstromdichte eingestellt. Die entsprechende Intensit~t im t t R betrs etwa 520 erg/em~-sec, im BL etwa 760erg/cm2.sec. Die verwendeten Quantenstromdichten ermSglichen eine sehr iihnliche Intensitiit des logarithmischen Waehstums (gemessen a]s Trockensubstanz-Akkumnlation) im HR und im BL (vgl. z.B. Abb. 4 bei Morn% 1965).

4. Die Au]arbeitung des Materials a) Ernte. Die Kulturen werden in den jewefligen Lichtfeldern ,,geerntet", d.h. so rasch wie m6glich mit einer ll-G-4-Fritte abgenutscht, in Ws fiberfiihrt und sofort in Trockeneis eingefroren. AuI diese Weise kSnnen biochemisehe Ver~nderungen des Materials weitgehend unterbunden werden. b) Trocknung und Trockengewichtsbestimmung. Fiir die Experimente mit Ir Uridin werden die Proben 12 Std bei --3=[= 2~ in einer Gefriertrocknungsanlage (Modell L 1, Phywe AG, GSttingen) lyophylisiert und ansehlieBend biochemiseh analysiert. Bei allen anderen Experimenten wird das Troekengewicht als BezugsgrSBe mitbestimmt. (In Vorversuehen wurde festgestellt, dab beim Protein- und RNS-Gehalt keine Unterschiede zwischen vakuumgetrocknetem, gefriergetroeknetem und Frischmaterial bestehen.) Die Proben werden zu diesem Zweek 4 Std in einem Vakuumtrockenschrank bei 6 0 • 1 7 6 und 20Torr vorgetrocknet und danach 4 Std fiber Sflikagel abgekfihlt. Die Bestimmung des Trockengewichts er~olgt nach dem Schema: 1 Std Troekenschrank--4 S%d Abkfihlen--Wiegen. Diese ]?olge wird mehrmals bis zur Gewichtskonstanz wiederholt (mindestens dreimal). Das Leergweicht der Wi~gegl~sehen wird vorher au~ dieselbe Weise ermittelt. c) Homogenisation. Im AnschluI~ an die Trockengewichtsbestimmung bzw. die Geffiertroeknung werden die Proben unter Kfihlung mit Trockeneis-~thanol im 1 50 ml bei Experimenten, die l~nger als 6 Tage Vorbehandlung und 7 Tage Wachstum dauerten. Abkfirzungen: Standard-Hellrot = HR; Standard-Blaulicht ~ BL.

Die Regulation der RNS-Ssmthese in Farngametophyten dutch Licht

235

jewefls ersten Extraktionsmittel mit dem ,,Ultra-Turrax" Typ 18/2 (Janke & Kunkel KG, Staufen i. Br.) homogenisieI~. Die Temperatur yon -- 10~ wird dabei nieht iiberschritten. Die Homogenate werden getrennt aufgearbeitet. Bei dem Umsetzversueh yon ttR-->BL werden aus den jeweiligen Homogenaten aliquote Teile zur quantitativen Bestimmung des Protein-N entnommen.

d) Bestimmung des Protein-N. Fiir unsere Fragestellung gen~gt es, das Gesamtprotein zu bestimmen. Die Methode schliel~t sieh im wesentlichen einem urspriinglieh yon HOT~A und OsAwA (1958) entwickelten und yon O n ~ n ~ R o ~ und Mom~ (1963) fiir die Dryopteris-G~metophyten modifizier~en Verf~hren an. Bei dieser Art der Darstellung der ,,Protein"-Fraktion werden aul3er den alkoholl6sliehen N-Verbindungen - - z.B. freie Aminos~uren, Amide, Chlorophyll - - auch die Nucleins~uren yon den unlSsliehen N-Verbindungen getrennt. Der N-Gehalt der einzelnen Proben wird nach der Mikro-Kjeldahl-Methode bestimmt. e) Bestiramungder RNS. Die Vorextraktionen des homogenisierten Materials zur Entfernung yon Pigmenten, s~urelSslichen Phosphaten, Lipiden und anderen stSrenden Substanzen wird, leicht modifiziert, naeh S ~ I n und K~OTKOV (1960) durchgefiihrt (vgL W~ID~ER u.Mitarb., 1965). Die RNS wird direkt ~us dem Riiekstand nach einer yon WOLLGIV,EN und P ~ a ~ E ~ (1963) ~usgearbeiteten Methode mittels Ribonuclease a bestimmt. Der Geha]t an RNS wird durch Messung der Extinktion bei 260 nm (Zeiss-Spektralphotometer PMQ II, Sehiehtdicke 1 cm), die mit einem Umrechnungsfaktor multipliziert wird, ermittelt. Dieser Faktor wurde durch mehrt~ache Analyse eines nach V~SC~WRund C ~ F ~ (1948) sowie S ~ v ~ , LACK~ZANN und S~OL]~Ns (1938) gereinigten l%NS-Pr~parates ermittelt. Die Extinktionen bei 250 nm und 280 nm werden jeweils mitgemessen und aus ihnen die ExtinktionsE 280 nm E 250 nm quotienten E 260 nm und E 260 nm gebildet, die als Reinheitskriterien der Extrakte dienen. Die Quotienten stimmen gut mit den bei NI]~A~T und POULS]~N (1963) angegehenen Werten iiberein. Die angegehenen MeBwerte sind stets Mittelwerte aus mindestens vier unabh~ngigen Versuchsans~tzen und beziehen sich auf den RIqS- bzw. Protein-~-Gehalt einer Sehale.

5. Experimente mit 14C-Uridin Die Farnkulturen werden nach 6 Tagen Vorbehandlung ins Standard-tIRFeld gebracht und dort 6 Tage gehalten. D~nach wird die 14C-Uridin16sung direkt im t t R - F e l d appliziert. Aus jeder Schale werden mit einer 20 ml-Vollpipette mit angeschmolzenem Kolben 20 ml der N~hrlSsung abgesaugt und sofort 0,2 ml laCUridinlSsung mittels einer Enzympipette gleichm~i3ig vom Sehalenrande her zugesetzt. Das Pr~parat Uridine-C 14 (U); 230 me/ml~ (The Radiochemieal Centre Amersham, England) war zuvor zu einer StammlSsung der Konzentration 2,5 ~e/ml in Aqua bidest, gelSst worden; es ergibt sich somit in tier N~hrlSsung eine Konzentration yon 0,025 ~zc/ml. Pro Parallele werden 5 Schalen verwandt und jewefls 2 Parallelen pro Punkt im gleiehen Versuchsansatz bestimmt. Zum Absaugen und zur Applikation der radioaktiven LSsung braucht man fiir 10 Schalen rd. 20 rain. Urn diese Zeitspanne wird demgem~B die Aussaat yon je 10 Schalen gestaffelt. Da die Einbaurate bei ver~nder~er Lichtqualit~t studiert werden soll, wird die H~lfte der Schalen sofort nach Applikation im BL-Feld exponiert. Jede Erschfitterung der Schalen ist zu vermeiden. Nach 1, 2, 3, 4, 6 und 8 Std Inkubation werden die Proben direkt in den jewefligen Feldern ,,geerntet". Dabei wird so kombiniert, da~ 3 Ribonuclease, reinst aus Pankreas, frei yon Protease und DNase, 45 KunitzE/rag; yon Serva, Entwicklungslabor, Heidelberg.

236

It. D g c ~ und It. Mom~:

jede Parallele im Mittel gleieh lung der 14C-UridinlSsung ausgesetzt ist. Die Vorkeime werden eingefroren und bis zur Aufarbeitung naeh vorangegangener Lyophy]isierung in der Tiefkiihltruhe bei --20~ aufbewahrt. Die RNS-Analyse folgt dem fiblichen Schema. Vom Itomogenat werden aliquote Tefle zur Bestimmung der Gesamtaktiviti~t des Homogenats abgezweigt. Die RNS-Menge, die als Bezugsgr6Be der RadioaktivitEt dient, wird wie fiblieh bestimmt. Zur Bestimmung der Radioaktivit~Lt werden aliquote Teile des Nuc]eotidgemisches in Verbrermungsr5hrchen iiberlfihrt und unter einem Luftstrom getrocknet. Die Messung erfolg~ dann nach nasser Totalverbrennungder Probe zu CO2, das in einer Ionisationskammer aufgefangen wirdt. Mit Hflfe eines Schwingkondensator-Elektrometers Cary 31 wird der in der Kammer erzeugte Ionisationsstrom gemessen. Dabei entsprechen 28 mV/min = 1 nc. Die spezifisehe AktivitEt wird als ne/izg I~NS angegeben.

6. Messung morphologischer Gr6/3en Bei allen biochemisehen Versuchen wird eine sorgfEltige morphologische Kontrolle mitgeffihrt. Dazu werden aus mindestens zwei Schalen Vorkeime entnommen und der allgemeine Habitus sowie LEnge und Breite mikroskopiseh kontrolliert. I~ur solche Kulturen, die morphologiseh ,,in Ordnung" sind, werden ffir die biochemischen Analysen verwendet. Die selten auftretenden Versuchsst6rungen k6nnen auf diese Weise eliminiert werden.

7. Das Bezugssystem Es erscheint siimvoll, die ,,biologische" Einheit, d.h. in unserem Fall das Kollektiv der Gametophyten in einer Kulturschale, die jewefls eine anniihernd gleiche Individuenzahl enth~lt, als Bezugssystem zu wi/hlen. Unsere Daten reprEsentieren also die RNS, die ein durchschnittlicher Gametophyt ( = Vorkeim) enth~l~. Da gleichaltrige Kulturen annEhernd gleiche Trockensubstanz besitzen, k6nnen wir, um den Aussaatfehler zu korrigieren, die RNS-Werte durch die Trockensubst~nz dividieren (relativer RNS-Gehalt). Andere Bezugssysteme wie ,,Zelle" oder ,,DNS" sind, wie die morphologische Betrachtung zeigt, wenig sirmvoll.

8. Fehler- und Signi/ilcanzbetrachtung Ffir jeden Kurvenpunkt werden mindestens vier unabh~ngige Analysen mit jeweils 4 5 Kulturschalen durehgefiihrt. Der einfache, mittlere Fehler wird mit Hilfe der Wissenscha/tlichen Tabellen, Documenta Geigy (1960) als Bruchteil des mittleren Extrembereiches geschi~tzt. Er liegt bei der I~NS zwischen 2 und 4%, beim Protein-N bei 1%. Der An~lysenfehler der RNS-Bestimmung betri~gt 1%. Signifikanzbetrachtungen werden nach dem t-Test (Documenta Geigy) durchgefiihrt. Experimentelle O a t e n

1. Der RNS-Gehalt im Dauer-HR und im Dauer-BL Wie die Abb. 1 zeigt, n i m m t der R N S - G e h a l t pro K u l t u r s e h a l e i m B L u n d i m I-IR zun/~chst stark zu. I m B L b e o b a c h t e t m a n fiber d e n a Die Verbrennung der 1)roben sowie die t~adioaktivmessung konnten freundlieherweise an einer yon Dr. H. J. R~ISEN~ entwickelten Apparatur durchgefiihrt werden. Eine ausfiihrliche Besehreibung dieser Apparatur und des iKeBverfahrens ist in Vorbereitung.

Die Regulation der l~NS-Synthese in Farngametophyten durch Licht

237

ganzen Versuchszeitraum hinweg eine stetige Zunahme; im H R hingegen bleib~ der t~NS-Gehalt pro Kulturschale (d.h. praktiseh pro Vorkeim) vom 6. Tag ab weitgehend station/~r. - - Es ist daran zu erinnern, dab unter unseren Versuchsbedingungen die Troekensubstanz pro Kultursehale fiber den ganzen Versuehszeitraum hinweg logarithmisch zunimmt. Auch der Proteingehalt pro Kulturschale nimmt sowohl im BL als aueh im H R stetig zu (vgl. O~L]~Zel~OT~und MoI-~, 1963, Abb. 2). - Die durch BL bewirkte Zunahme des l~IqS-Gehalts in den Vorkeimen (bezogen auf den l~NS-Gehalt im HI~) kommt schneller zustande air die dureh das BL bewirkte Zunahme des Proteingehalt~s (Abb. 2). Diese r--.i

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Beobachtung vertr/~gt rich gut mit der Vorstellung, dab BL fiber die Sequenz Gen->l~NS--->Protein, also fiber eine differentielle Genaktivierung, den Proteingehalt der Vorkeime erh6ht. Freilieh bleibt die Frage offen, wo die ,,BL-RNS" und das ,,BL-Protein" zu lokalisieren rind. Nach eytochemischen Untersuehungen yon Mn_~z~L (pers6nliehe Mitteilung) befindet rich in den f~digen, streng polar strukturierten Vorkeimen, die im H E entstehen, die Hauptmenge der RNS am apikalen Pol, wo das Spitzenwachstum vonstatten geht (vgl. M o ~ , 1956 b). Aul3erdem ]assen rich cytochemisch betr~ehtliehe l~NS-]Y[engen in den Chloroplasten lokalisieren. Diese rind am apikalen Pol konzentriert (Mog~, 1 9 5 6 b ) . In den flgchigen Vorkeimen, die im BL entstehen, ist naeh den Beobachtungen yon Mls~z~n 6 Tage nach der Keimung die I~NS noeh weitgehend homogen fiber die Zellen verteilt. Auch die Chloroplasten, in denen ebenfalls cytoehemisch RNS naehgewiesen werden kann, rind im BL gleiehm~l~ig fiber den Vorkeim verteilt. Beim Waehstum im HI~ simmt die Zahl der Chloroplasten pro Vorkeim nur l~ngsam zu; im BL hingegen, wo alle Zellen etwa gleichm~6ig mit Chloroplasten ansgestattet rind, ist die Zunahme der Zellzahl mit einer entsprechenden Zunahme

238

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nach Keimung

Abb. 3. Der relativeRNS-Gehal~ der Vorkeime (bezogen auf Trockensubstanz) im Hellrot und im Blaulicht

d e r C h l o r o p l a s t e n z a h l p r o V o r k e i m v e r b u n d e n . M a n muB offensichtlieh d a m i t rechnen, d a b die stetige Z u n a h m e d e r R N S i m B L z u m Tefl m i t d e r stetigen Z u n a h m e y o n Chloroplasten in V e r b i n d u n g zu b r i n g e n ist. D e r r e l a t i v e R N S - G e h a l t n i m m t z u n a e h s t s t a r k zu u n d d a n n wieder a b (Abb. 3). D e r U n t e r s c h i e d zwisehen H R - u n d B L - V o r k e i m e n ist be-

Die Regulation der l~NS-Synthese in Farngametophyten durch Licht

239

tr~chtlich. 6 Tage nach der Keimung ist der relative l~NS-Gehalt der BL-Vorkeime 15% grSl]er als der der HR-Vorkeime. Bemerkenswert ist, dal] der relative l~NS-Gehalt einer Optimumkurve folgt, w~hrend der relative Proteingehalt im BL best~ndig zunimmt und auch im IIl~ jedenfalls nicht abnimmt ( O n ~ E ~ o T ~ und Mon~, 1963, Abb. 3). Der QuoProtein-N tient I ~ N S nimmt sowohl fin BL als auch im H R best~ndig zu (Abb. 4). Wenn man die bereehtigte Annahme maeht, dab der grSl~te Teil des ,,BL-Proteins" Strukturprotein der Chloroplasten darstellt

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Zeit nach Keimung Abb. 4. Der auf R ~ S bezogene Protein-lV-Gehalt im Hellrot and Blaulicht. Diese Da~en soUen veranschaulichen, daI~ der Proteingetmlt der u sowohl im Hellrot als auch im BIaulicht sehr viel starker zunimmt als der RlqS-Gehalt. (Protein-Daten aus OHLEN~O~H und ~I0m~, 1963)

(KAs]~vrm und MOHR, 1965), sO folgt aus diesem Vergleieh, daf~ auch in den Chloroplasten die RNS fin Verhs sehr viel weniger zunimmt als das Protein. Diese Daten stehen in Einklang mit der fiblichen Auffassung fiber die Bedeutung der RNS bei der Synthese yon Enzym- und Strukturprotein.

2. Die Ver~inderungen des RNS-Gehalts bei Umsetzexperimenten Die im letzten Abschnitt dargestellten Daten geben keine befriedigende Auskunft darfiber, ob der durch BL erhShte RNS-Gehalt der Vorkeime in einen kausalen Zusammenhang mit der blaulichtspezifischen ~r gebracht werden kann. Eine diesbezfigliche Information kann man eher yon Umsetzexperimenten erwarten. Im Prinzip geht man so vor, dal~ man die Vorkeime 6 Tage im HI~ heranzieht und die Kulturen dann ins BL bringt. Man mil~t dann in mSglichst engen Intervallen die durch BL bewirkten morphogenetischen Ver~nderungen, die des Proteingehalts und des RNS-Gehalts.

H. D~vIvL~und tt. Mom~:

240

Bringt m a n die im H R 6 Tage herangewachsenen f~digenVorkeime ins BL, so kann m a n m i t Itilfe des Index B 1 / B 2 verfolgen, wie raseh sieh die BL-Wirkung morphologiseh manifestiert (Abb. 5). Man nfitzt bier die Beobachtnng aus, dal~ sich unter dem EinfluB yon BL zuerst die Protonemaspitze verdiekt, ehe die erste L/~ngswand eingezogen wird. An den Ver~nderungen des I n d e x B 1 / B 2 kann man erkennen, dal~ bereits 3 - - 6 Std nach Beginn des BL die morphogenetisehe Wirkung dieser Strahlung sicher zu registrieren ist 5. Die starke ErhShung des Proteingehalts tritt hingegen erst zwischen der 6. und der 12. Std naeh BLBeginn in Erseheinung (Abb. 6), zu einem Zeitpunkt also, zn dem sich

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die BL-spezifisehe Umsteuerung der Morphogenese bereits manEestiert hat. Man mu8 arts diesem Resultat den Schlul~ ziehen, dab jedenfalls der grSBte Teil des unter dem EinflnB yon BL zus~ttzlieh entstehenden Proteins nicht in eine unmittelbare kausale Beziehung zu den morphogenetischen Ver~nderungen gebraeht werden kann. Es erseheint jedoch mSglich, dab die leichte, allerdings nicht befriedigend signifikante ErhShnng des Proteingehalts nach 3 bzw. 6 Std BL mit der BL-spezifisehen Umsteuerung der Morphogenese in Zusammenhang zu bringen ist. - I m Gegensatz zum Proteingehalt steigt der l~NS-Gehalt der Vorkeime naeh dem Umsetzen ins BL rasch an (Abb. 6) ; es hat den Anschein, dab dieser Anstieg wesentlich rascher erfolgt als die Ver~nderungen des I n d e x 5 Ffir die Bestimmung der Proteindaten und fiir die Unters~iitzung bei der Aufstellung des Index B1/B 2 danken wir Frau Dr. I-I.KxsE~m.

Die l~egulation der RNS-Synthese in ~rngametophyten dutch Lich~ 241 "~.

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Abb. 6. Die Ver&nderungen des relativen Proteingehalts (bezogen a t e Trockensubstanz) u n d des r e l a t i v e n l~,5TS-Gehalts u n t e r d e m EinfluB yon ~laulieht. Die K e i m l i n g e w u r d e n 6 T a g e i m I-Iellrot herangezogen u n d d a n n ins Blaulieht umgesetzt. Die Kontrollen verblieben i m tIellrot. - - D e r relative 2rotein- bzw. l ~ T S - G e h a l t n a e h 6 T a g e n ]:[ellrot ist = 100 gesetzt. (Die P r o t e i n - D a t e n wuzden yon F r a u Dr. I t . KXSEYmr b e s t i m m t )

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Zeit nach Zugabe von

l&c-Uridin

k b b . 7. Die k t E n a h m e -con l~C-Uridin (0,025 ~e/ml N~hrlSsung) in die F a r n v o r k e i m e i m Hellrot bzw. ]31aulicht. - - Z e i t p u n k t der A p p l i k a t i o n : N a c h 6 Tagen/{ellrot-:Kultur. Die D a t e n zeigen, dab die Qualitat des L i e h t s z u m i n d e s t w&bl'end der ersten 3 Std n a e h Z u g a b e y o n U r i d i n keinen EinfluB a t e die G e s a m t a u f n a h m e y o n 14C ha~

B1/B ~. Diese Daten stehen im Einklang mit der Auffassung, da6 BL fiber eine differentielle Genaktivierung eine rasehe /~NS-Synthese veranlagt. Es ersehein~ wenig wahrseheinlieh, dab diese BL-abh/ingige l~NS-Synthese aussehlieglieh die Chloroplasten betrifft.

H. D~rrr~Mund H. MOH~:

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3. Er]assung der RNS-Synthese mit Hil/e von laC- Uridin Dot Einbau yon laC-Uridin in die RNS-Fraktion ist ein gewisses MaB ffir die Intensit~t der RNS-Synthese. Wir stellen uns die l~rage, ob und wie rasch fin Umsetzversuch yon H R nach BL der 14C-Uridin-Einbau in die RNS-Fraktion gesteigert wird. - - Wie die Abb. 7 zeigt, wird die Gesamtaufnahme an x4C in die Vorkeime durch die Lichtqualiti~ kaum beeinflul~t. Innerhalb der ersten 3 Std nach dem Umsetzen, die uns besonders interessieren, ist die Aufnahme an 14C im H R und im BL identisch. z

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Zeit noch Zugabe yon l h c - U r i d i n A b b . 8. Der ]~influB y o n Blaulicht u n d Hellro~ auf die spezifische A k t i v i t ~ t der RI~S [nohzg I~NS] n a c h Applikation won 14C-Uridin (0,025 ~ c / m l N~hrlOsung). Z e i t p u n k t der Applikation: N a c h 6 T a g e n Hellrot-Kultur

Mit einer Verarmung des Mediums an laC-Uridin brauehen wir nicht zu rechnen, da 8 Std nach z4C-Uridin-Zugabeerst rund 10% der zugefiig~en Radioaktivit~t aufgenommen worden sind. - - Die Veriinderungen des Index Bz/B ~ werden dureh die Zugabe yon 14C-Uridin nicht im mindesten beeinfluBt. Die Daten der Abb. 8 deuten darauf hin, dal~ BL die Syntheserate der R N S rasch und betri~chtlich erhSht. Es schein~, dab sowohl im H R als auch im BL bereits 3 SSd nach Zugabe des 14C-Uridins die unter unseren Versuchsbedingungen maximale spezifische Aktivit~t erreicht ist, d.h., die I~NS ist sowei~ ,,durchmarkiert", wie es unter unseren Versuchsbedingungen mSglich ist. Dieser Befund deute$ darauf hin, dab die gesamte RIqS der Vorkeime einem raschen ,,turnover" unterliegt. Diskussion a) Die Da~en der Abb. 6 und 8 stiitzen die Auffassung, dab die BLspezifische Morphogenese fiber eine differentielle Genaktivierung be-

Die Regulation der RNS-Synthese in Farngametophyten durch Lich~ 243 wirkt wird (vgl. Einleitung). Es erseheint n/~mlich unwahrscheinlich, dab die rasche Bfldung von ,,Blaulicht-RNS" aussehlieJ]lich mit der ers~ 6--9 Std naeh BL-Beginn einsetzenden Vermehrung des Chloroplastenproteins (Abb. 6; KASEI~IR und M o ~ , 1965) in Zusammenhang zu bringen ist. Aufgrund der cytochemischen Daten yon M~NZV,L (persSnliche Mitteflung) mfissen wir allerdings damit rechnen, dab auch bei unserem Objek~ ein relativ grol]er RNS-Antefl in den Chloroplasten lokahsiert ist. Auch bei anderen Systemen scheint der Antefl der Chloroplasten-RNS an der Gesamt-RNS der grfinen Zellen recht hoch zu sein. tt]~]~.~ (1963) gibt ffir Bohne, Tabak und Spinat Werte im Bereich yon 25--30% an; B ~ A w ] ~ A ~ u.Mitarb. (1959)geben ffir Euglena gracilis 10--20 % an; JANows~ (1965) publizierte ffir Acetabularia mediterranea einen Wert yon 80%. Die Synthese yon I~NS in den Chloroplasten ist mehrmals bewiesen worden, am fiberzeugendsten erscheinen die Experimente yon Sc~tw]~iG~ und B ~ o ] ~ (1964), die den Einbau yon ~4CUracil in die RNS isolierter Chloroplasten aus entkernten Acetabularien nachgewiesen haben. Wir haben bislang bei den Vorkeimen keinen quanti~ativen Anhaltspunkt daffir, welchen Anteil die l~NS-Synthese in den Chloroplasten unter BL-EinfluB an der Gesamt-RNS-Synthese hat. Wit kSnnen lediglich aufgrund der betr/~ehthehen zeitliehen Differenz zwischen RNS- und Proteinanstieg nach dem Umsetzen ins BL vermuten, dab die zun~chst gebfldete ,,BL-RNS" mit der BL-spezifischen Morphogenese in Zusammenhang zu bringen is~. Es erscheint g/instig, in weiteren Arbeiten den Nachweis zu ffihren, dab unter dem EinfluB yon BL Enzyme neu synthetisiert werden, die im H R fehlen oder nur in geringen Mengen vorliegen. Erst damit kSnnte wohl der /iberzeugende Beweis gehefert werden, dab der BL-spezifisehen Morphogenese die Bildung spezifiseher Enzyme zugrunde liegt. Die Daten der vorliegenden Arbeit kSnnen aber immerhin als gute Indizien daffir dienen, dab diese Auffassung richtig ist. b) Arbeiten, die mit Acetabularia-Arten durehgef/ihrt wurden, spreehen daf/ir, dab aueh eine Regulation der l~orphogenese auf der Ebene der Translation in Betraeht zu ziehen ist (z. B. ZETSC]~E, 1966 ; tt;~MME~LInG und Z~TSC~, 1966). RICHT~ (1962) und R I C ~ und Kxgsc~ST~I~ (1966) konn~en bei Acetabularia mediterranea zeigen, daI] der photomorphogenetische Einflul] yon BL auf die Hutbfldung auch in Abwesenheit des Zellkerns vonstatten geht. Eine differentielle Genaktivierung scheint also hier keine Rolle zu spielen. Im Fall der Farnvorkeime deute~ indessen der starke und rasch einsetzende EinfluB yon BL auf die RNS-Synthese darauf hin, dab BL Genaktivit~ten zu ver/~ndern vermag. Aueh die Tatsache, dab Konzentrationen yon Aetinomyein D, die das Wachstum der fflamentSsen ttR-Vorkeime nicht beeinflussen, die durch BL bewirkte Morphogenese im Umsetzexperiment stark hemmen (vgl. Mon-~, 1965), deutet darauf hin, dab BL fiber eine

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H. DRv~x~und It. Mon~:

Genaktivierung wirkt. Wir k6nnen freilieh nicht aussehlie$en, da$ das BL aueh auf der Ebene der Translation eine Wirkung ausiibt. c) Blaulicht hat, wie neuerdings gezeigt wurde, bei vielen pflanzlichen Systemen eine positive Wirkung auf die Protein- und RNS-Synthese. Bei Chlorella und anderen Grfinalgen z.B. fanden KOWALLIK (1962) und PIRSON und KOWALLIK (1964) bei anni~hernd gleieher TroekensubstanzAkkumulation mehr Protein und Rl~S fin Blau- als fin Rotlicht. Das Blaulicht hat bei diesen Systemen aber keinen erkennbaren EinfluB auf die Morphogenese. Bei den Bl~ttern yon Kalanchoe rotundi/olia indessen, die CASPE~ und P m s o ~ (1965) untersuchten, scheint die l~Srderung der t~NS- und Proteinsynthese im Blaulicht mit einem spezifischen Effekt auf die Morphogenese verbunden zu sein. - - Bei den Farnvorkeimen mfissen wir sowohl bei der I~NS- als aueh bei der Proteinsynthese mit zwei versehiedenen Vorgi~ngen reehnen: 1. Blaulicht - - mSglieherweise absorbiert durch Carotinoide (KoWALLIK,1965) - - steigert die autonome I~NS- und Proteinsynthese der Chloroplasten. - - 2. B l a u l i c h t - - m6glicherweise absorbiert dutch Flavoproteine im Cytoplasma - - erm6glieht fiber eine differentielle Genaktivierung die Bildung spezifischer Enzyme, auf deren Aktivit~t die blaulichtspezifische 1Y[orphogenese zurfickzuffihren ist. Zusammen~assung In einer frfiheren Arbeit wurde gezeigt (O~LE~OTH und Mon~, 1963), dab sieh die Vorkeime yon Dryopterig ]ilix-mas im Blaulicht zu ,,norma]en" zweidimensionalen Prothallien mit einem relativ hohen Proteingehalt entwickeln. I m I-Iellrot hingegen bilden sich Zellf~den ( ~ Protonemen) aus, deren Proteingehalt bei gleieher Photosyntheseleistung wesentlich geringer ist. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dab auch der RNS-Gehalt im BlauHcht stets grSl~er als im Hellrot ist. Die blaulichtabh~ngige I~NSZunahme setzt zeitlich frfiher ein als die Proteinzunahme. I n Umsetzexpei4menten yon ttellrot nach Blau manifestiert sich die morphogenetische Umsteuerung der Protonemen zeitlich eher als die blaulichtabh~ngige Steigerung des Proteingehalts. K~SEMm und MOH~ (1965) konnten zeigen, dab es sich bei dem ,,Blauliehtprotein" in erster Linie um eine Vermehrung des Strukturproteins der Chloroplasten hanhandelt. Die blanlichtabhi~ngige RNS-Zunahme dagegen ist sp~testens zum Zeitpnnkt der morphologischen Umsteuerung fal~bar. Dieses Ergebnis wird dadurch gestfitzt, dab Blau]icht im Vergleich zu ttellrot rasch einen gesteigerten Einbau yon 1~C, als 14C-Uridin (U) geboten, in die RNS-Fraktion verursacht. Das Blaulicht scheint in den Farnvorkeimen zwei verschiedene Vorg&nge zu verursachen. 1. Steigerung einer autonomen Proteinsynthese in den Chloroplasten. 2. AuslSsung oder Steigerung einer spezifisehen Enzymsynthese im Cytoplasma. Die blau-

Die Regulation der RNS-Synthese in Farngametophyten durch Licht

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lieht~bh~ngige Steigerung der R N S - S y n t h e s e seheint dami~ in Zus~mm e n h a n g zu stehen. Die D a t e n d e r vorliegenden A r b e i t w e r d e n als I n dizien daffir angesehen, d~l~ d a s B l a u l i c h t seine m o r p h o g e n e t i s c h e W i r k u n g fiber eine differentielle G e n a k t i v i e r u n g ausfibt. Die Arbeit wurde durch Sachbeihilfen der Deutschen Forschunggemeinschaft und der Stfftung Volkswagenwerk gefSrdert. - - M-~NFEED WEI~NEI~ danken wir herzlieh ffir methodisehe Anleitung.

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